המחקר של מנגנוני התנגדות שנרכשו הרומן יתרום לפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות יעילות ובטוחות יותר בחולים עם סרטן סוכן עמיד וסרטן resectable. למרבה הצער, מקרים שבהם עמידות לסמים לא הצליח לפתח אינם מדווחים בדרך כלל. שיטת הסלמה זו במינון צעד אחר צעד נחשבת לטכניקה האמינה ביותר להשגת תאים עם התנגדות נרכשת.
כדי לקבוע את הריכוז המתאים של עמידות לאפטיניב, תאי PC-9 תרבותיים בגודל בינוני בצמיחה בצלחת 10 ס"מ של תאים שטופלו בתרבות תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%פחמן דו-חמצני. תן שימוש חוזר בתאי PC-9 בריכוז בינוני של 4 פעמים עד 10 ל-4 למיליליטר של ריכוז בינוני של צמיחה, ומושיב את התאים ב-50 מיקרוליטרים של מתלי תאים ל הבאר במיקרו-לוחית של 96 בארות. לאחר אינקובציה של לילה באינקובטור תרבות התאים, לטפל בתאים עם 50 microliters של פתרון afatinib ל הבאר, בשישה שכפולים של הריכוזים המצוין, ולאחר דגירה של 96 שעות באינקובטור תרבות הליקוט, להוסיף 15 microliters של צבע MTT לכל באר.
לאחר ארבע שעות באינקובטור תרבות התא, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון מנוון/עצירה לכל באר, ומחזירים את הצלחת לאנקובטור בן לילה. למחרת בבוקר, למדוד את הצפיפות האופטית ב 570 ננומטר על קורא מיקרופלסטיק. לחשיפה אפטיניבית מתמשכת, תאי PC-9 תרבותיים במנות P-100 המכילים 10 מיליליטר של מדיום צמיחה עד שהתאים מגיעים תת-קליטה.
מעבירים את תרבויות התת-מודע לשלוש מנות P-100 חדשות של תשעה מיליליטר של מדיום צמיחה לכל צלחת תרבות ראשונית, ומחזירים את התאים לאנקובטור של תרבות התאים. למחרת בבוקר, להוסיף 0.1 nanomolar, או 1/10 של ריכוז מעכבות חצי מקסימלי של afatinib, לכל קבוצה של שלוש מנות תרבות. כאשר התאים שטופלו באפטיניב הופכים לתת-מודעים, השתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לערבב ביסודיות את התרבויות, והעבירו מיליליטר אחד של תאים מכל מנה לתשעה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי במנות P-100 חדשות.
הוסף 10%-20% ריכוזים גבוהים יותר של afatinib לתרבויות החדשות, הגדלת ריכוז afatinib על ידי הסלמה במינון צעד אחר צעד בכל פעם התרבויות להגיע תת-שפע על פני תקופה של 10 עד 12 חודשים. כאשר מגיעים לריכוז אפטיניב של מיקרומולר אחד, בצע את בדיקת MTT כפי שהוכח כדי לאשר כי התאים פיתחו עמידות afatinib. כדי לקבוע את עקומת הצמיחה עבור קווי התא, תרבות ההורים PC-9 ושלושת קווי התא עמיד afatinib במדיום הצמיחה ב החממה לתרבות התא במשך 24 שעות.
תן שימוש חוזר בתאים מכל תרבות בתאים של חמש פעמים עד שליש למיליליטר של ריכוז בינוני של צמיחה, ומושב 12 100 מיקרוליטר משכפל את כל אוכלוסיית התאים ל הבאר במיקרופלסטיק של 96 בארות. לאחר מכן בצע את הבדיקה MTT בימים אפס, אחד, שניים, שלוש, חמש, ושבע של תרבות כפי שהוכח, ולתכנן את התוצאות באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי מתאים. כדי לזהות שינויים קולטן גורם גדילה אפידרמיס, או ביטוי DNA גנומי EGFR, על ידי ניתוח שרשרת פולימראז תעתיק הפוך, לבודד DNA גנומי מתרבות התא של עניין באמצעות ערכת טיהור DNA על פי הוראות היצרן.
למדוד את הריכוז של 25 ננוגרם מיקרוליטר ריכוזים של DNA גנומי מבודד על ספקטרופוטומטר. לאחר מכן להגביר 50 ננוגרם של DNA גנומי באמצעות תערובת מאסטר ירוק SYBR, ולנתח את התוצאות באמצעות מערכת זיהוי תגובת שרשרת פולימראז פולימראז מבוסס פלואורסצנטיות. כדי לזהות שינויים בביטוי DNA גנומי EGFR על ידי רצף, להגביר את ה-DNA הגנומי באמצעות פריימרים ספציפיים עבור EGFR exons 19 כדי 21.
לאחר מכן לטהר את מוצרי PCR מוגברת באמצעות ערכת טיהור PCR על פי הוראות היצרן, ורצף אמפיקונס. כדי לזהות שינויים בביטוי חלבון קולטן גורם גדילה אפידרמיס על ידי ניתוח כתם מערבי, לטפל בתאים עם afatinib במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, לשטוף את תרבות התא פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS קר כקרח לכל תרבות לכל לשטוף.
Lyse התאים במאגר בדיקת מים radioimmunoprecipitation, בתוספת 1% מעכבי פרוטאז קוקטייל מעכבי פוספטאז קוקטייל שתיים ושלוש במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה. השתמש בהקדמת החומצה הביצינצ'ונית כדי לקבוע את ריכוז החלבון של דגימות ליזאט.
התאימו את דגימות החלבון ל-0.5, או מיקרוגרם אחד לריכוזי מיקרוליטר, במאגר מדגם 4-X, והרתיחו את הדגימות ב-96 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לניתוח כתם מערבי של הדגימות, להרכיב צלחות זכוכית מנוקה אתנול ומרחבים, ולטעון את התבנית עם 8% פוליאקרילמיד ג'ל עם תוספי הניסיון המתאימים. בזמן הג'ל הוא פולימריזציה, להוסיף פתרון ג'ל לערום לתבנית מתאימה, להכניס את המסרק, ולאפשר ג'ל הערימה כדי polymerize במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.
כאשר שני הג'לים יש polymerized, למקם אותם במנגנוני אלקטרופורזה ולמלא את המיכל עם חיץ פועל. לאחר מכן לטעון אחד 20-30 מיקרוליטר נפח של כל דגימת חלבון לתוך כל באר, ולהפעיל את הג'ל ב 180 וולט. עצרו את האלקטרופורזה לאחר כ-60 דקות, לאחר שחזית הצבע זורמת מתוך הג'ל, ושטפו את הג'ל עם מלוחים עם טריס-באגירה, בתוספת טווין, למשך שעה עד שתי דקות.
מעבירים את החלבונים על קרום פלואוריד פוליווינילידין על ידי סופג יבש למחצה במשך שעה וחצי בזרם קבוע של 300 מיליאמפר. חוסמים את הממברנה עם חלב יבש 5% דל שומן מדולל עם מלוחים טריס-buffered בתוספת תמיסת Tween במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לבדוק את הממברנה עם הנוגדנים המתאימים של עניין בארבע מעלות צלזיוס לילה.
למחרת בבוקר, לשטוף את הממברנות עם שלוש 10 דקות שטיפה של מלוחים טריים טריים tris-buffered לכל לשטוף לפני חשיפת הממברנה לנוגדן המשני המתאים עבור אחד עד אחד ו 1/2 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את הממברנה חמש פעמים עם מלוחים טריים עם חיץ טרי לכל שטיפה וחשפו את הממברנה לתמיסת חמילומינציה משופרת להדמיית אותות באמצעות סרטים. כאן, הירידה שנצפתה בהתפשטות התאים של תאי PC-9 הורים בתגובה לריכוזים הגוברים של afatinib מאויר, המאשר כי תאים PC-9 רגישים לחשיפה afatinib.
עם זאת, אף אחד משלושת קווי התאים העמידים בפני אפטיניב לא מדגים דיכוי של התפשטות תאים תחת חשיפה אפטיניבית. קווי תאים עמידים בפני אפטיניב מציגים עקומות צמיחה איטיות משמעותית מאשר תאי PC-9 הורים. תאים עמידים בפני אפטיניב מבטאים רמות גבוהות משמעותית של דנ"א גנומי EGFR וביטוי חלבון EGFR מאשר תאי PC-9 הורים.
רצף EGFR מדגים שתאי PC-9 מציגים 15 מחיקות של זוגות בסיסים ב- EGFR exon 19, ו- EGFR מסוג Wild באקסון 20. תא אחד ושני תאי קו תא עמידים בפני אפטיניב, לעומת זאת, מפגינים הגברה של אקסון EGFR 19 מסוג פראי. קו תאים עמיד Afatinib שלושה תאים מכילים את אותן מחיקות זוג בסיס 15 exon EGFR 19 כמו בתאי PC-9, אבל מוטציה נקודה T790M נצפתה EGFR exon 20.
צמיחת תאים יכולה להיות איטית למדי כאשר ריכוז המעכב קרוב לערך IC-50. אל תדון בתרבות, שכן התא ימשיך להתרבות בהדרגה. אסטרטגיות אלה פותחו כדי לחקות את התנאים שבהם חולי סרטן לפתח עמידות רלוונטית קלינית כדי להעריך מנגנוני התנגדות שנרכשו ולפתח אסטרטגיות טיפוליות בטוחות ויעילות.
