Изучение новых механизмов приобретенной резистентности будет способствовать разработке более эффективных и безопасных терапевтических стратегий у пациентов с устойчивыми к раку и ресекаблемым раком. К сожалению, случаи, когда лекарственная устойчивость не развивалась, как правило, не сообщаются. Этот метод эскалации дозы stepwise считается наиболее надежным методом для получения клеток приобретенного сопротивления.
Для определения соответствующей концентрации афатиниб-сопротивления, культура PC-9 клеток в среде роста в 10-сантиметровой клеточной культуры обработанных блюдо при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Resuspend PC-9 клетки в четыре раза-10-четыре клетки на миллилитр роста средней концентрации, и место клеток на 50 микролитров клеточной подвески на колодец в 96-ну микроплета. После ночной инкубации в инкубаторе клеточной культуры, лечить клетки с 50 микролитров раствора afatinib на колодец, на шесть репликаций указанных концентраций, и после 96-часовой инкубации в инкубаторе культуры отбраковки, добавить 15 микролитров красителя MTT к каждой хорошо.
После четырех часов в инкубаторе культуры клеток, добавить 100 микролитров раствора solubilization/stop к каждой хорошо, и вернуть пластину в инкубатор на ночь. На следующее утро измерьте оптическую плотность на уровне 570 нанометров на считыватель микроплатформ. Для непрерывного воздействия афатиниба, культуры PC-9 клеток в P-100 блюда, содержащие 10 миллилитров среды роста, пока клетки не достигнут субвлияния.
Перенесите субвлияние культур в три новых блюда P-100 из девяти миллилитров среды роста на одно начальное блюдо культуры и верните клетки в инкубатор клеточной культуры. На следующее утро добавьте 0,1 наномоляра, или 1/10 половины максимальной ингибирующей концентрации афатиниба, к каждому набору из трех культурных блюд. Когда клетки, обработанные афатинибом, станут субвлиятельными, используйте одноми миллилитровую пипетку, чтобы тщательно смешать культуры, и перенесите один миллилитр клеток из каждого блюда в девять миллилитров свежей среды роста в новых блюдах P-100.
Добавьте от 10%до 20%более высоких концентраций afatinib к новым культурам, увеличивая концентрацию afatinib stepwise эскалацией дозы each time культуры достигают subconfluency над 10-к 12-месячным периодом. Когда концентрация afatinib одного микромолара достигнута, выполните анализ MTT, как попродемонстрировано, чтобы подтвердить, что клетки разработали афатиниб-сопротивление. Для определения кривой роста клеточных линий, культуры родительского PC-9 и трех устойчивых к афатинибу клеточных линий в среде роста в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 часов.
Resuspend клетки от каждой культуры в пять раз-10-к-третьей клетки на миллилитр роста средней концентрации, и место 12 100-микролитр репликации каждой популяции клеток на колодец в 96-ну микроплета. Затем выполните анализ MTT на нулевом, одном, двух, трех, пяти и семи культурных днях, как было продемонстрировано, и свяжите результаты с помощью соответствующей программы статистического анализа. Для выявления изменений в рецепторе эпидермального фактора роста, или экспрессии геномной ДНК EGFR, путем обратного анализа цепи транскриптазы, изолируйте геномную ДНК от клеточной культуры, представляющих интерес, используя комплект для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя.
Измерьте концентрацию 25-нанограммовых микролитровых концентраций изолированной геномной ДНК на спектрофотометре. Затем усилить 50 нанограммов геномной ДНК с помощью SYBR зеленый мастер смеси, и анализировать результаты с помощью флуоресценции основе обратной транскриптазы полимеразы системы обнаружения цепной реакции. Чтобы определить изменения в экспрессии геномной ДНК EGFR путем секвенирования, усилить геномную ДНК с помощью конкретных грунтовок для EGFR экзонов 19 до 21.
Затем очистить усиленные продукты ПЦР с помощью комплекта очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, и последовательности amplicons. Для выявления изменений в экспрессии белка рецептора фактора эпидермального роста с помощью западного анализа помарки, лечить клетки с afatinib в течение 24 часов. После 24 часов, мыть клеточные культуры два раза с пятью миллилитров ледяной PBS на культуру за стирку.
Lyse клетки в радиоиммунопреципиентации анализ буфера, дополненный 1%protease ингибитор коктейль и ингибиторы фосфатазы коктейль два и три в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации собирайте лизы путем центрифугации. Используйте анализ бицинхониновой кислоты для определения концентрации белка лизатных образцов.
Отрегулируйте образцы протеина до 0.5, или одного микрограмма в концентрации микролитара, в буфере образца 4-X, и отварить образцы на 96 градусах Celsius на 5 минут. Для западного анализа помарки образцов, собрать этанол очищенные стеклянные пластины и промеченные, и загрузить плесень с 8%полиакриламид гель с соответствующими экспериментальными добавками. В то время как гель полимеризуется, добавьте решение для укладки геля в соответствующую форму, вставьте гребень и дайте гель для укладки полимеризировать в течение 20-30 минут при комнатной температуре.
Когда оба геля полимеризуются, поместите их в электрофорезный аппарат и заполните бак бегущим буфером. Затем загрузите один 20-30-микролитровый объем каждого образца белка в каждую хорошо, и запустить гель на 180 вольт. Остановите электрофорез примерно через 60 минут, как только краситель фронт вытекает из геля, и мыть гель с трис-буфер соленый раствор, дополненный Tween, в течение одной-двух минут.
Перенесите белки на поливинилиновую фторсодержатую мембрану полусухой блотой в течение одного и 1/2 часов при постоянном токе 300 миллиампер. Заблокив мембрану 5%несжиренным сухим молоком, разбавленным трис-буферным солевым раствором плюс раствор Tween в течение одного часа при комнатной температуре. Далее, зонд мембраны с соответствующими антителами интереса на четыре градуса по Цельсию в одночасье.
На следующее утро, мыть мембраны с тремя 10-минутные моет свежие трис-буферный солевой раствор на стирку, прежде чем подвергать мембрану соответствующие вторичные антитела в течение одного к одному и 1 / 2 часа при комнатной температуре. Затем промыть мембрану пять раз со свежим трис-буфером солевого раствора на стирку и подвергать мембрану повышенной химилюминесценции раствор для визуализации сигнала с помощью пленок. Здесь иллюстрируется снижение, наблюдаемое в клетках пролиферации родительских клеток PC-9 в ответ на повышение концентрации афатиниба, подтверждающее, что клетки PC-9 чувствительны к воздействию афатиниба.
Тем не менее, ни одна из трех устойчивых к афатинибу клеточных линий не демонстрирует подавления пролиферации клеток при воздействии афатиниба. Устойчивые к Афатинибу клеточные линии демонстрируют значительно более медленные кривые роста, чем родительские клетки PC-9. Устойчивые к Афатинибу клетки выражают значительно более высокие уровни экспрессии геномной ДНК EGFR и белка EGFR, чем родительские клетки PC-9.
Секвенирование EGFR показывает, что клетки PC-9 обладают 15 базовыми парой удалений в EGFR exon 19 и диким типом EGFR в exon 20. Afatinib устойчивых одной и двух клеток линии клеток, однако, демонстрируют усиление дикого типа EGFR exon 19. Устойчивые к Афатинибу клеточные линии три клетки содержат те же 15 базовых парных удалений в EGFR exon 19, что и в клетках PC-9, но точеная мутация в T790M наблюдается в EGFR exon 20.
Рост клеток может стать довольно медленным, когда концентрация ингибитора близка к значению IC-50. Не обсуждай культуру, так как клетка будет продолжать размножаться постепенно. Эти стратегии были разработаны для имитации условий, при которых онкологические больные развивают клинически-релевантную устойчивость для оценки приобретенных механизмов устойчивости и разработки безопасных и эффективных терапевтических стратегий.
