Die Untersuchung neuartiger erworbener Resistenzmechanismen wird zur Entwicklung wirksamerer und sichererer therapeutischer Strategien bei Patienten mit krebserkranken und resezierbarem Krebs beitragen. Leider werden Fälle, in denen sich die Arzneimittelresistenz nicht entwickelt hat, in der Regel nicht gemeldet. Diese schrittweise Dosiseskalationsmethode gilt als die zuverlässigste Technik zur Gewinnung erworbener Resistenzzellen.
Um die geeignete Afatinib-Resistenzkonzentration zu bestimmen, kulturieren PC-9-Zellen in Wachstumsmedium in einem 10-Zentimeter-Zellkultur-behandelten Gericht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Setzen Sie die PC-9-Zellen bei einer viermal-10-zu-den-vier-Zellen pro Milliliter Wachstumsmedium Konzentration aus, und setzen Sie die Zellen auf 50 Mikroliter Zellsuspension pro Brunnen in einer 96-Well-Mikroplatte. Nach einer nächtlichen Inkubation im Zellkultur-Inkubator die Zellen mit 50 Mikrolitern Afatinib-Lösung pro Brunnen, bei sechs Replikationen der angegebenen Konzentrationen und nach einer 96-stündigen Inkubation im Inkubator der Keulungskultur 15 Mikroliter MTT-Farbstoff zu jedem Brunnen hinzufügen.
Nach vier Stunden im Zellkultur-Inkubator 100 Mikroliter Löslichkeit/Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte über Nacht an den Inkubator zurückgeben. Messen Sie am nächsten Morgen die optische Dichte auf einem Mikroplattenleser mit 570 Nanometern. Für eine kontinuierliche Afatinib-Exposition, Kultur PC-9-Zellen in P-100-Schalen mit 10 Milliliter Wachstumsmedium, bis die Zellen Subkonfluenz erreichen.
Übertragen Sie die subkonfluenten Kulturen in drei neue P-100-Gerichte mit neun Millilitern Wachstumsmedium pro anfänglichem Kulturgericht und geben Sie die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurück. Am nächsten Morgen 0,1 Nanomolar oder 1/10 der halbmaximalen hemmenden Konzentration von Afatinib zu jedem Satz von drei Kulturgerichten hinzufügen. Wenn die mit Afatinib behandelten Zellen subkonfluent werden, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die Kulturen gründlich zu mischen, und übertragen Sie einen Milliliter Zellen von jeder Schale auf neun Milliliter frisches Wachstumsmedium in neuen P-100-Gerichten.
Fügen Sie den neuen Kulturen 10% bis 20% höhere Konzentrationen von Afatinib hinzu, wodurch die Afatinib-Konzentration durch schrittweise Dosiseskalation jedes Mal erhöht wird, wenn die Kulturen über einen Zeitraum von 10 bis 12 Monaten subkonfluenz erreichen. Wenn eine Afatinib-Konzentration eines Mikromolaren erreicht wird, führen Sie den MTT-Assay durch, um zu bestätigen, dass die Zellen eine Afatinib-Resistenz entwickelt haben. Um die Wachstumskurve für die Zelllinien zu bestimmen, Kultur Eltern PC-9 und die drei afatinib-resistenten Zelllinien in Wachstumsmedium im Zellkultur-Inkubator für 24 Stunden.
Setzen Sie die Zellen aus jeder Kultur bei einer fünfmal-10-bis-dritten Zelle pro Milliliter Wachstumsmedium Konzentration aus, und setzen Sie sich 12 100-Mikroliter pro Bohrkörper pro Bohrkörper in einer 96-Well-Mikroplatte. Führen Sie dann den MTT-Test an den Tagen Null, eins, zwei, drei, fünf und sieben der Kultur aus, wie gezeigt, und zeichnen Sie die Ergebnisse mithilfe eines geeigneten Softwareprogramms für statistische Analysen auf. Um Veränderungen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors oder der genomischen DNA-Expression EGFR durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenanalyse zu identifizieren, isolieren Sie genomische DNA aus der Zellkultur, die von Interesse ist, indem Sie ein DNA-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden.
Messen Sie die Konzentration von 25-Nanogramm-Mikroliter-Konzentrationen der isolierten genomischen DNA auf einem Spektralphotometer. Verstärken Sie dann 50 Nanogramm genomischer DNA mit einem SYBR-Grün-Master-Mix und analysieren Sie die Ergebnisse mit einem fluoreszenzbasierten Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktions-Detektionssystem. Um Veränderungen der genomischen DNA-Expression von EGFR durch Sequenzierung zu identifizieren, verstärken Sie die genomische DNA mit spezifischen Primern für egFR-Exons 19 bis 21.
Reinigen Sie dann die verstärkten PCR-Produkte mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, und sequenzieren Sie die Amplicons. Um Veränderungen in der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Protein-Expression durch Western-Blot-Analyse zu identifizieren, behandeln Sie die Zellen mit Afatinib für 24 Stunden. Waschen Sie nach 24 Stunden die Zellkulturen zwei Mal mit fünf Millilitern eiskaltem PBS pro Kultur pro Waschgang.
Lyse die Zellen in Radioimmunpräzipitierstas-Assay-Puffer, ergänzt mit 1%Protease-Hemmer-Cocktail und Phosphatase-Inhibitoren Cocktail zwei und drei für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Lysate durch Zentrifugation sammeln. Verwenden Sie den Bicinchoninsäure-Assay, um die Proteinkonzentration der Lysatproben zu bestimmen.
Stellen Sie die Proteinproben auf 0,5 oder ein Mikrogramm pro Mikroliter konzentrationen im 4-X-Probenpuffer ein, und kochen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 96 Grad Celsius. Für die Western-Blot-Analyse der Proben, ethanolgereinigte Glasplatten und Abstandshalter montieren und die Form mit einem 8%Polyacrylamid-Gel mit den entsprechenden experimentellen Ergänzungen beladen. Während das Gel polymerisiert, stapeln Gellösung zu einer geeigneten Form hinzufügen, legen Sie den Kamm, und lassen Sie das Stapelgel für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren.
Wenn beide Gele polymerisiert sind, legen Sie sie in das Elektrophoresegerät und füllen Sie den Tank mit Laufpuffer. Dann laden Sie ein 20-bis 30-Mikroliter Volumen jeder Proteinprobe in jeden Brunnen und führen Sie das Gel bei 180 Volt. Stoppen Sie die Elektrophorese nach ca. 60 Minuten, sobald die Farbstofffront aus dem Gel fließt, und waschen Sie das Gel mit tris-gepufferter Salin, ergänzt durch Tween, für ein bis zwei Minuten.
Übertragen Sie die Proteine auf eine Polyvinylidenfluoridmembran durch halbtrockenes Blotting für eine und 1/2 Stunden bei einem konstanten Strom von 300 Milliampere. Blockieren Sie die Membran mit 5% fettfreier Trockenmilch, die mit tris-gepufferter Salin- und Tween-Lösung verdünnt wird, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Als nächstes sondieren Sie die Membran mit den entsprechenden Antikörpern von Interesse bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Morgen die Membranen mit drei 10-minütigen Waschungen frischer Tris-gepufferter Saline pro Wäsche waschen, bevor sie die Membran für ein bis ein s/2 Stunden bei Raumtemperatur dem entsprechenden Sekundärantikörper aussetzen. Waschen Sie die Membran dann fünfmal mit frischer Tris-gepufferter Salin pro Waschgang und setzen Sie die Membran einer verbesserten Chemilumineszenzlösung zur Signalvisualisierung mit Filmen aus. Hier wird die beobachtete Abnahme der Zellproliferation von elterlichen PC-9-Zellen als Reaktion auf die Erhöhung der Konzentrationen von Afatinib veranschaulicht, was bestätigt, dass PC-9-Zellen empfindlich auf Afatinib-Exposition reagieren.
Keine der drei afatinibresistenten Zelllinien zeigt jedoch eine Unterdrückung der Zellproliferation unter Afatinib-Exposition. Afatinib-resistente Zelllinien weisen deutlich langsamere Wachstumskurven auf als elterliche PC-9-Zellen. Afatinib-resistente Zellen drücken signifikant höhere Konzentrationen der genomischen EGFR-DNA und der EGFR-Proteinexpression aus als elternde PC-9-Zellen.
Die EGFR-Sequenzierung zeigt, dass PC-9-Zellen 15 Basenpaarlöschungen in EGFR exon 19 und Wildtyp EGFR in exon 20 aufweisen. Afatinib-resistente Ein- und Zweizelllinienzellen weisen jedoch eine Verstärkung des Wildentyps EGFR exon 19 auf. Afatinib-resistente Zelllinie drei Zellen enthalten die gleichen 15 Basenpaar Deletionen in EGFR Exon 19 wie in PC-9-Zellen, aber eine Punktmutation in T790M wird in EGFR exon 20 beobachtet.
Das Zellwachstum kann recht langsam werden, wenn die Inhibitorkonzentration nahe dem IC-50-Wert liegt. Diskutieren Sie nicht über Kultur, da sich die Zelle nach und nach weiter ausbreiten wird. Diese Strategien wurden entwickelt, um die Bedingungen nachzuahmen, unter denen Krebspatienten klinisch relevante Resistenzen entwickeln, um erworbene Resistenzmechanismen zu bewerten und sichere und wirksame therapeutische Strategien zu entwickeln.
