הפרוטוקול שלנו לביטוי חלבון ללא תאים משתמש בתמצית גולמית פעילה מאוד מהחיידק הגדל במהירות Vibrio natriegens, המוכן באמצעות תהליך פשוט ויעיל של שני שלבים של sonication-צנטריפוגה. הכנת תמצית תאים גולמיים וסינתזת חלבונים נטולת תאים יכולה להיות מושגת תוך יום עד יומיים על ידי משתמש יחיד המאפשר לשלב טכניקה זו בקלות בצינורות עבור יישומי ביו-פרודוקציה או ביולוגיה סינתטית. כדי להתחיל לשטוף מיליליטר אחד של תרבות ויבריו natriegens לילה על ידי צנטריפוגה אותו בצנטריפוגה ספסל ב 10, 600 פעמים גרם לדקה אחת.
שאף את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור, ולחץ מחדש במיליליטר אחד של מדיה LB-V2 טרייה. לחסן מיליליטר אחד של תרבות לילה שטף לתוך ליטר אחד של מדיה צמיחה LB-V2 טרי בבקבוק ארלנפייר Erlenmeyer מבולבל אוטומטית עם כיסוי סטרילי כדי להשיג אחד לאלף מנות דילול. לגדול תרבות ב 30 מעלות צלזיוס תוך טלטול ל 225 סל"ד.
השתמש בספקטרופוטומטר כדי לפקח על התרבויות OD 600. וכאשר הוא מגיע 1.0 פלוס או מינוס 0.2 לקצור את התרבות על ידי צנטריפוגה אותו בשני צינורות 500 מיליליטר ב 3, 500 פעמים גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מניחים על קרח. שאף את העל-טבעי ועבד את גלולת הכדור מיד.
לפני תחילת הליך תות התא לקרר טרי מוכן S30 lysis מאגר pH 7.7 עד כארבע מעלות צלזיוס, השתמש 10 מיליליטר של מאגר תזה S30 קר זה כדי להשעות מחדש את כל כדורי הנובעים מאותה תרבות ליטר אחד. ולהעביר השעיה לצינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה השעיה זו ב 3, 500 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שאף את supernatant מבלי להפריע גלולה למקם אותו על קרח.
עבודה בחדר קר להוסיף 500 microliters של חיץ תזה S30 קר לכדור בצינור 50 מיליליטר להציב על קרח. השתמש בקצה פיפטה משעמם רחב כדי לעכל מחדש את גלולה בזהירות להעביר אותו צינור שני מיליליטר גם על קרח. על מנת לייצר תמציות גולמיות פעילות מאוד עלינו לוודא כי התאים אינם מדוללים יתר על פני עם מאגר S30, אבל יש מספיק נוזל עבור sonication יעיל.
ממלאים מקור 600 מיליליטר בקרח וממקם מחזיק צינור שני מיליליטר על גבי הקרח. מערבולת הצינור בקצרה כדי הומוגניזציה התאים. לחץ כדי להסיר את כל התאים בתחתית המכסה, והמקום לתוך מחזיק צינור עם כובע פתוח.
קצה sonicator התחתון לתוך ההשעיה התא בצינור, כך שהוא ממש מתחת לפני השטח הנוזליים. הכן את הגדרת sonication באמצעות sonicator ו בדיקה עם קוטר קצה 1/8 אינץ '. הגדר את sonicator בתדר 20 קילוהרץ ו 50% משרעת.
זמן דופק של 10 שניות, ותנות דופק של 60 שניות. הפעל את פרוטוקול sonication הדופק במשך שלושה מחזורים. ואז תמצית תאים גולמיים צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g במשך 30 עד 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס עד ליאזט הוא ללא כל פסולת הסלולר.
בדיקה חזותית של תות התאים כאשר sonication מתרחש הוא קריטי כדי להבטיח כי sonication עבד כצפוי. עבודה בחדר קר aliquot 50 microliters של supernatants וכתוצאה מכך צינורות חדשים שני מיליליטר הקפדה לא להפריע גלולה. כדי להבהב להקפיא תמציות תאים גולמיים אלה למקם את הצינורות לתוך מחזיק צינור עם מחרוזת טבילה מחובר לטבול לתוך dewar המכיל חנקן נוזלי ולבדוק אם קפוא.
כדי לבצע ביטוי חלבון ללא תאים באמצעות תבנית DNA להפשיר 10X אנרגיה פתרון אב לערבב, 4X חומצת אמינו מאסטר לערבב aliquots, ותבנית DNA בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להסיר את הפולימראז T7 RNA ו RNAse מעכבי מניות מן המקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס ולה מניחים על קרח. לאחר תבנית ה-DNA, 10X תווי אנרגיה מאסטר לערבב, ו 4X חומצת אמינו מאסטר לערבב מופשרים, מקום על קרח.
הכינו תערובת מאסטר תגובה נטולת תאים על ידי הוספת כל רכיב בסדר המדויק לצינור של שני מיליליטר על קרח, והניפו בעדינות את הצינור לאחר כל תוספת לתערובת הראשית. הסר Vibrio natriegens תא גולמי lysate מן המקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס ולה מניחים על הקרח במשך 10 עד 20 דקות עד מופשר. הוסיפו את הנפח המתאים של תמצית תאים גולמיים מופשרת לתערובת המאסטר של התגובה נטולת התאים וערבבו בעדינות בעזרת פיפטה.
כדי לבצע ביטוי חלבון נטול תאים נקודת קצה באמצעות thermocycler, תחילה להוסיף 10 microliters של התגובה ללא תאים לערבב ל הבאר של החלק התחתון של צלחת PCR 96 היטב הקפד לערבב את התערובת הראשית על ידי הבהוב הצינור בעדינות בין כל העברה לצלחת PCR. צנטריפוגה הצלחת ב 1, 000 פעמים g במשך 10 שניות כדי בריכה כל תערובת הורים שאולי היה דבוק לצדדים של בארות. ואז לאטום את בארות עם דבק צלחת כדי למנוע אידוי.
מניחים את הצלחת לתוך התרמוצ'ילר להגדיר ב 26 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם להגדיר ב 105 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של התגובות בצלחת PCR למשך שלוש שעות לפחות, חלבונים מבוטאים יכולים להיות מטוהרים, מכומתים ומשמשים לתהליכים במורד הזרם. כדי לפקח על קינטיקה ביטוי חלבון ללא תאים באמצעות pipette קורא צלחת 10 microliters לכל באר של תערובת מאסטר התגובה ללא תאים לתחתית צלחת 384-well מים שחורים עם תחתיות זכוכית ברורות.
ולאטום את בארות עם דבק צלחת ברורה כדי למנוע אידוי. מניחים את צלחת ההתזה לתוך קורא צלחת להגדיר ב 26 מעלות צלזיוס דגירה במשך שלוש עד שש שעות תוך ניטור אורך גל פלורסנט המתאים / פליטה המתאימים חלבון לידי ביטוי. מערכת ביטוי ללא תאים המתוארת בפרוטוקול זה משיגה את התוצאות הטובות ביותר עם תבנית DNA פלסמיד המניבה כמות חלבון גבוהה משמעותית מאותה כמות של דנ"א ליניארי כפי שמוצג על ידי נקודות קצה ובדיקות קינטיות.
mRNA שנוצר על ידי תגובות שעתוק במבחנה יכול לשמש גם, אבל כמויות גבוהות יותר של mRNA נדרשים. התשואה של ייצור החלבון הושפעה באופן משמעותי על ידי ריכוז של מגנזיום ויוני אשלגן. בתנאים אופטימליים נמצא כי ריכוז יוני המגנזיום האופטימלי הוא 3.5 מילימולר ואשלגן יון, 80 מילימולר.
לפיכך, סטיות מריכוזי היונים האופטימליים הללו עלולות לגרום לירידה ביכולתה של מערכת ביטוי זו לייצר תשואות משמעותיות של חלבונים. חשוב לשמור את כל הריג'ים על הקרח או לעבוד בחדר קר ככל האפשר. בנוסף, sonication הנכון והשלם הוא קריטי להצלחת פרוטוקול זה.
בעקבות פרוטוקול זה למשתמשים תהיה היכולת לבטא חלבונים בפורמט תפוקה גבוהה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לטהר מסך לפעילות של חלבונים רבים ושונים. טכניקה זו מדגימה את השימוש באורגניזמים חדשים בעלי תכונות ייחודיות לביטוי ללא תאים. Vibrio natriegens הוא חיידק הגדל במהירות הילופילית שעשוי להציע תנאים ייחודיים לביטוי חלבונים או מולקולות קטנות שלא נחקרו בעבר באורגניזמים מבוססים.
