השיטה משמעותית משום שהיא מאפשרת זיהוי נוירוכימי עם רזולוציה מרחבית ותכובית גבוהה אשר יכול לשפר באופן פוטנציאלי בשיטות vivo של זיהוי נוירוכימי. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי היא שיטה מהירה, קלה לשחזור כדי לשפר את הרגישות ואת הרזולוציה הזמנית של זיהוי נוירוטרנסמיטר. הדגמת ההליך תהיה סנג'ה מוהנראג' ופולין וונינברג, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, להפריד חומר סיבי פחמן לגדילים בודדים ולמשוך סיבי פחמן בקוטר שבעה מיקרומטר אחד מגדיל. חבר קו ואקום נימי זכוכית borosilicate ושואפים את סיבי הפחמן לתוך נימי. ואז לחתוך 10 ס"מ על ידי 25 סנטימטר חתיכת קרטון לשמש מחזיק אלקטרודה.
קלטת מגבת נייר סביב הקרטון כתמיכה, ולאחר מכן להכניס את נימי לתוך מחזיק האלקטרודה בזהירות לאבטח אותו למשוך נימי אנכי. הגדר את מושך נימי למשוך את נימי הזכוכית כדי להתחדד עדין עבור חומרים אלקטרודה ולהתחיל אותו. לאחר משיכת גימורים סליל החימום התקרר, לחתוך את סיבי הפחמן המחברים את האלקטרודות משוך צינור.
מוציאים בזהירות את המיקרו-אלקטרודים מהמוציא נימי. בהדרכת סטריאוסקופ או מיקרוסקופ, השתמש בלהב חד או במספריים כירורגיים כדי לקצץ את סיבי הפחמן הבולטים על כל אלקטרודה לאורך של כ-100 עד 150 מיקרומטר. לאחר מכן, בבקבוקון 25 מיליליטר, להשתמש ספוגית כותנה לערבב 10 גרם של אפוקסי עם 0.2 מיליליטר של הקשחה.
מלא בקבוקון נוסף עם אצטון. עבור כל אלקטרודה, לטבול את קצה סיבי הפחמן אפוקסי במשך 15 שניות ולאחר מכן לטבול אותו אצטון במשך שלוש שניות כדי להסיר אפוקסי עודף. לאחר epoxying, אלקטרודות אפוקסיד נרפאים בתנור במשך שלוש שעות ב 125 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, השתמש micromanipulator למקם microelectrode סיבי פחמן באלקטרודה התייחסות כסף כסף-כלוריד בתמצית 0.5 מילימולרית של חומצה כלורואורית ב 0.1 כלוריד אשלגן מיטורי טוחן. חבר את האלקטרודות לפוטנציוסטט עם מיקרואלקטרוניקה מסיבי פחמן כאלקטרודה העובדת. סרוק את האלקטרודה מ-0.2 וולט למינוס וולט אחד ב-50 מילי-וולט לשנייה למשך 10 מחזורים כדי לבצע תצהיר אלקטרודה.
זה קריטי כדי לייעל את הפרמטרים להפקדת ציפוי הזהב. ציפוי רב מדי יגרום לרעש ועומס אות בעוד ציפוי קטן מדי לא ישפר את הזיהוי הנוירוכימי. לפני הבדיקה, להכין פתרון מלאי 10 מילימולר של דופמין בחומצה perchloric ועל ליטר של pH 7.4 PBS מבוסס חיץ במים deionized.
פיפטה מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי דופמין לתוך 10 מיליליטר של חיץ כדי להפוך פתרון אחד בערך מיקרומולר דופמין. לאחר מכן חבר מיקרואלקטרוניקה מסיבי פחמן ואלקטרודה התייחסות כלוריד כסף כסף כדי potentiostat. לתקן את האלקטרודה סיבי פחמן ואת האלקטרודה התייחסות בשלב הראש של מנגנון תא זרימה ולהשתמש micromanipulator כדי להוריד אותם לתוך תא הזרימה.
צייר 60 מיליליטר של מאגר PBS לתוך מזרק. מלאו את תא הזרימה במאגר והרו את המזרק במשאבת מזרק. התחל לזורם חוצץ דרך תא הזרימה בקצב של מיליליטר אחד לדקה.
לאחר מכן להגדיר את potentiostat לסרוק מינוס 0.4 וולט ל 1.3 וולט ב 10 הרץ ו 400 וולט לשנייה. יש למרוח בקצרה את צורת הגל על המיקרו-אלקטרוד, להתבונן באוסצילוסקופ ולהתאים את הרווח כדי למנוע עומס יתר. תן microelectrode לצייד במשך 10 דקות במאגר.
ואז לצייר את פתרון דופמין מדולל לתוך מזרק ולחבר אותו ליציאת ההזרקה של תא הזרימה. הגדר את זמן הריצה הכולל על potentiostat ל 30 שניות. התחל להקליט את המידות, לחכות 10 שניות, ולאחר מכן להזריק 0.2 מיליליטר של פתרון דופמין לתוך תא הזרימה.
כאשר הריצה מסתיימת, לעבד את הנתונים עם תוכנת ניתוח voltammetry מחזורי בהבחנה גבוהה. תן microelectrode לצייד מחדש במשך 10 דקות לפני ביצוע בדיקה נוספת. כאשר הבדיקות הסתיימו, לנקות את תא הזרימה על ידי הזרקת שלושה מיליליטר של מים ושלושה מיליליטר של אוויר לתוך חיץ יציאות הזרקה שלוש פעמים.
סיבי פחמן מצופים דימוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה. העובי וגודל החלקיק של ציפויים חלקיקי זהב יכול להיות נשלט על ידי זמן התצהיר אלקטרודה. 20 דקות של תצהיר אלקטרודה הניבו ציפוי זהב עבה עם רכסים חדים בעוד חמש דקות הניבו ציפוי זהב אחיד דק.
למיקרואלקטרודים מצופים ננו-חלקיקים מזהב היו זרמי שיא חמצוניים גבוהים משמעותית וקינטיקה מהירה יותר להעברת אלקטרונים מאשר אלקטרודות לא משופנות. ציפוי חלקיקי הזהב לא היה השפעה משמעותית על היציבות של תגובות האלקטרודה כפי שהוכח כאן בתתיק של דופמין. הן אלקטרודות מצופות חלקיקים חשופות והן אלקטרודות מצופות זהב הגיבו באופן ליניארי לשינויים בקצב הסריקה בעוצמה גדולה בהרבה של שינוי באלקטרודות מצופות הזהב.
זה הצביע על כך ספיגת דופמין יכול להיות נשלט באמצעות קצב הסריקה. אלקטרודות מצופות חלקיקים חשופות וזהובות הגיבו באופן ליניארי בין ריכוזי דופמין של 100 ננומולרים ל-10 מיקרומולרים. עקומה אסימפטוטית נצפתה בריכוזים גבוהים יותר, המציין כי דופמין הוא רווי על פני השטח אלקטרודה.
היכולת לזהות שינויים נוירוכימיים בסולם זמן מהיר יותר וברגישויות גבוהות יותר תסייע לענות על שאלות מורכבות במדעי המוח. לשיטה זו יש גם שימושים בכימיה אנליטית, מטבולומיה ומדעי הסביבה. אמנם קל ללמוד, הדגמה חזותית היא קריטית ללמידה לעשות, לשנות, ולבדוק את microelectrodes.
כיוונים עתידיים עבור שיטה זו כוללים התאמת התצהיר של זהב וציפויים אחרים כדי להסביר עובי, גודל, צורה, ומורפולוגיה כדי לייעל את הזיהוי של נוירוטרנסמיטורים ספציפיים. החוקרים צריכים לתרגל טיפול בסיבים קטנים תחת מיקרוסקופ לפני שהם מנסים טכניקה זו. כמו כן, פתרון מלאי נוירוטרנסמיטר צריך להיות מוכן ברדס אדים כי הם משתמשים 1 חומצה על-טבעית טוחנית.
