El método es significativo porque permite la detección neuroquímica con alta resolución espacial y temporal que potencialmente puede mejorar los métodos in vivo de detección neuroquímica. La principal ventaja de esta técnica es que es un método rápido, fácil y reproducible para mejorar la sensibilidad y resolución temporal de la detección de neurotransmisores. Demostrando el procedimiento serán Sanuja Mohanaraj y Pauline Wonnenberg, estudiantes graduados de mi laboratorio.
Para empezar, separe el material de fibra de carbono en hebras individuales y tire de una sola fibra de carbono de siete micrómetros de diámetro de una hebra. Conecte una línea de vacío a un capilar de vidrio borosilicato y aspire la fibra de carbono en el capilar. Luego corta una pieza de cartón de 10 centímetros por 25 centímetros para servir como soporte de electrodo.
Pegue una toalla de papel alrededor del cartón como soporte, luego inserte el capilar en el soporte del electrodo y fíjelo cuidadosamente en un tirador capilar vertical. Configure el tirador capilar para tirar del capilar de vidrio a un fino cónico para los materiales de los electrodos e iniciarlo. Una vez que los acabados de tracción y la bobina de calentamiento se haya enfriado, corte la fibra de carbono que conecta los electrodos tirados por tubo.
Retire cuidadosamente los microelectrodos del tirador capilar. Guiado por un estereoscopio o microscopio, utilice una cuchilla afilada o tijeras quirúrgicas para recortar la fibra de carbono saliente en cada electrodo a unos 100 a 150 micrómetros de longitud. A continuación, en un vial de 25 mililitros, utilice un hisopo de algodón para mezclar 10 gramos de epoxi con 0,2 mililitros de endurecedor.
Llene otro vial con acetona. Para cada electrodo, sumerja la punta de fibra de carbono en epoxi durante 15 segundos y luego sumerja en acetona durante tres segundos para eliminar el exceso de epoxi. Después de la epoxiing, los electrodos epoxied se curan en el horno durante tres horas a 125 grados Celsius.
A continuación, utilice un micromaniprógrafo para colocar un microelectrodo de fibra de carbono en un electrodo de referencia de cloruro de plata-plata en una solución de 0,5 mililitrolares de ácido cloroáurico en cloruro de potasio acuoso molar 0,1. Conecte los electrodos a un potenciostato con un microelectrodo de fibra de carbono como electrodo de trabajo. Escanee el electrodo de 0,2 voltios a menos un voltio a 50 milivoltios por segundo durante 10 ciclos para realizar la deposición de electrodos.
Es fundamental optimizar los parámetros para depositar el recubrimiento de oro. Demasiado recubrimiento causará ruido y sobrecarga de señal, mientras que demasiado poco recubrimiento no mejorará la detección neuroquímica. Antes de la prueba, preparar una solución de 10 mililitrolares de dopamina en ácido perclórico y alrededor de un litro de pH 7.4 tampón basado en PBS en agua desionizada.
Pipetear un microlitros de la solución de stock de dopamina en 10 mililitros de tampón para hacer una solución de dopamina de aproximadamente un micromolar. A continuación, conecte un microelectrodo de fibra de carbono y un electrodo de referencia de cloruro de plata y plata a un potenciostato. Fije el electrodo de fibra de carbono y el electrodo de referencia en la etapa principal del aparato de células de flujo y utilice el micromaniprógrafo para bajarlos a la celda de flujo.
Dibuje 60 mililitros del tampón PBS en una jeringa. Llene la celda de flujo con tampón y monte la jeringa en una bomba de jeringa. Comience a fluir el búfer a través de la celda de flujo a una velocidad de un mililitro por minuto.
A continuación, configure el potenciostato para buscar menos 0,4 voltios a 1,3 voltios a 10 hercios y 400 voltios por segundo. Aplique brevemente la forma de onda al microelectrodo, observe el osciloscopio y ajuste la ganancia para evitar la sobrecarga. Deje que el microelectrodo se equilibre durante 10 minutos en el búfer.
A continuación, extraiga la solución de dopamina diluida en una jeringa y conéctela al puerto de inyección de la célula de flujo. Establezca el tiempo total de ejecución en el potenciostato en 30 segundos. Comience a registrar las mediciones, espere 10 segundos y luego inyecte 0,2 mililitros de solución de dopamina en la celda de flujo.
Cuando finalice la ejecución, procese los datos con software de análisis de voltammetría cíclica de alta definición. Deje que el microelectrodo se vuelva a equilibrar durante 10 minutos antes de realizar otra prueba. Una vez finalizadas las pruebas, limpie la celda de flujo inyectando tres mililitros de agua y tres mililitros de aire en el búfer y los puertos de inyección tres veces.
Las fibras de carbono recubiertas fueron imágenes con microscopía electrónica de barrido. El grosor y el tamaño de partícula de los recubrimientos de nanopartículas de oro se pueden controlar por el tiempo de deposición del electrodo. 20 minutos de deposición de electrodos arrojaron una gruesa capa de oro con crestas afiladas, mientras que cinco minutos produjo un fino recubrimiento de oro uniforme.
Los microelectrodos de fibra de carbono recubiertos con nanopartículas de oro tenían corrientes oxidativas pico significativamente más altas y cinética de transferencia de electrones más rápida que los electrodos no modificados. El recubrimiento de nanopartículas de oro no tuvo ningún efecto significativo en la estabilidad de las respuestas de los electrodos como se muestra aquí en una solución de dopamina. Los electrodos recubiertos de nanopartículas desnudas y doradas respondieron linealmente para escanear cambios en la velocidad con una magnitud mucho mayor de cambio en los electrodos recubiertos de oro.
Esto indicó que la absorción de dopamina podría ser controlada a través de la tasa de exploración. Los electrodos recubiertos de nanopartículas desnudas y doradas respondieron linealmente entre concentraciones de dopamina de 100 nanomolares a 10 micromolares. Se observó una curva asintomática a concentraciones más altas, lo que indica que la dopamina está sobresaturada en la superficie del electrodo.
La capacidad de detectar cambios neuroquímicos en una escala de tiempo más rápida y en sensibilidades más altas ayudará a responder preguntas complejas en neurociencia. Este método también tiene usos en química analítica, metabolómica y ciencia ambiental. Si bien es fácil de aprender, la demostración visual es fundamental para aprender a hacer, modificar y probar los microelectrodos.
Las instrucciones futuras para este método incluyen ajustar la deposición de oro y otros recubrimientos para tener en cuenta el grosor, tamaño, forma y morfología para optimizar la detección de neurotransmisores específicos. Los investigadores deben practicar el manejo de fibras pequeñas bajo un microscopio antes de probar esta técnica. También, solución de aceite de neurotransmisor debe prepararse en una campana de humo porque utilizan 1 ácido percloro molar.
