פרוטוקול זה יכול לסייע למדען המעוניין במיקרוסקופיה לא ליניארית להבין את מרכיבי המפתח, את ההגדרה ואת הליך היישור של מיקרוסקופ המבוסס על פיזור אמן מגורה. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופיית SRS הם היכולות שלה לבצע הדמיה ללא תווית המבוססת על ניגודיות רטט ולרכוש תמונה תוך שניות ספורות. מיקרוסקופיית SRS לקחה הדמיה ללא תווית לגבהים חדשים במיוחד מחקרים של מבנים ביולוגיים מורכבים כגון שומנים, שהם היסוד לתאים וארכיטקטורה תאית.
אות SRS מזוהה כשינוי קטן בעוצמת קרן הגשוש והוא יכול להיפגם על ידי רעש. לכן סימן מדויק הוא קריטי. כדי להתחיל, ליישר את OPO ואת קרני לייזר ספיר טיטניום כך ששניהם מגיעים למיקרוסקופ.
לאחר מכן, מקם את הגלאים של חיישן מיקום קרן הלייזר בשתי עמדות בין מראה דיכרוית אחת ומראה שש. המיקום הראשון ממוקם קרוב למראה dichroic אחד והשני קרוב מראה שש. עבור כל מיקום, השתמש בחיישנים כדי לזהות את קואורדינטות X ו- Y של קרן OPO.
חשוב לציין, ודא כי קואורדינטות X ו- Y של קרן הלייזר טיטניום ספיר הם מאותו OPO בשתי המיקומים של גלאי החיישן. אם, במיקומים מסוימים, הקואורדינטות לא לחפוף, לכוון את ההטיה של המראה הסמוכה כדי לפצות. בצע הליך זה כדי ליישר את עמדות קרן ספיר טיטניום ביחס OPO לנתיב בין שש ושבע של המראה.
התקינו מראה נוספת על הר כפכפים בין מראה 6 ל-7 והפכו את הר המראה כדי לכוון את הקרן לתוך התיקון האוטומטי. הפעל את בקר התיקון האוטומטי, הפעל את יישום התוכנה במחשב השולט בו והגדר את בורג כוונון מרחק הקרן של התיקון האוטומטי למיקום הרגיל שלו ב- 8.35 מילימטרים. לאחר מכן, עצרו את קרן טיטניום ספיר ושחררו והקרנו את קרן OPO מהמראה הנוסף למראה הקלט של התיקון האוטומטי.
נסה לכוונן את מראה הקלט כדי למקסם את אות הדופק בלייזר כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, עצרו את קרן OPO ושחררו והקרנו את קרן ספיר טיטניום מהמראה המותקנת כפכפים למראה הקלט ולתוך התיקון האוטומטי. חזור על התאמת הקרן האופטימלית עד שאות התיקון האוטומטי, המוצג כאן, מתקבל.
עכשיו, להגדיר את בורג התאמת מרחק הקרן למיקום הצלב ב 7.30 מילימטרים. שחררו את שתי הקורות וסרקו את הקו המעוכב כדי לחפוף את שתי הקורות. השג אות מתאם צולב שנוצר, כפי שמוצג כאן.
לאחר מכן, להפוך את המראה רכוב כפכף כך הקורות יכול להגיע מראה שבע ואת ראש הסריקה של המיקרוסקופ. הסר את המרכז ולהשתמש בלחצן escape כדי לחזור בו באופן זמני את העדשה הסובייקטיבית 60x. לאחר מכן סובבו את חתיכת האף כדי להזיז את העדשה הסובייקטיבית 60x מהנתיב האופטי.
לאחר מכן, הר את הגלאי לחלק העליון של המיקרוסקופ באמצעות ההר המכאני החיצוני. חבר את פלט הגלאי באמצעות מסנן מעבר נמוך של 50 אום לאוצילוסקופ. עכשיו, הפעל את המעבד ששולט בראש הסורק והקרן את קרן OPO לתוך ראש הסורק של המיקרוסקופ.
נטר את אות ה- OPO והגדל את העוצמה הנמדדת על-ידי הגלאי באמצעות מתרגם XY. לאחר מכן, להעביר את הקרן מלייזר OPO ללייזר ספיר טיטניום ולוודא כי אות מתקבל גם עבור לייזר ספיר טיטניום. הדבר מצביע על כך ששתי הקורות מיושרות היטב.
לסיים את יישור הקרן על ידי סיבוב בחזרה את חתיכת האף כדי להציג את 60x סובייקטיבי. לאחר מכן, השתמשו בלחצן המיקוד מחדש במיקרוסקופ כדי להחזיר את המיקוד הסופי לעדשת המטרה של מיקרוסקופ 60x. לבסוף, למקם את המטרה, עם הגדלה של 40x, במקום מעובה מבלי לגעת או להפריע את המדגם.
הגדר את העוצמה של לייזרים טיטניום ספיר OPO נמדד לפני המיקרוסקופ ל 30 מילי וואט עבור שתי הקורות. לאחר מכן, הגדר את אורך הגל של לייזר OPO לערך אחר, ביחס לקודמו, כך המשאבה והגשוש אינם תהודה עם תדר הרטט של חרוזים. לאחר מכן, שחררו את שתי הקורות, כך שהן ייכנסו למיקרוסקופ.
הפעל את מתרגם ממוחשב קו עיכוב סריקה ולתזמן את העוצמה הנמדדת באמצעות מגבר הנעילה עבור כל מיקום של קו ההשהיה. המתן עד להשלמת סריקת קו ההשהיה. עכשיו, להגדיר את אורך הגל של OPO בחזרה 1076 ננומטר, כך המשאבה והגשוש נמצאים תהודה עם תדר הרטט של חרוזים.
הפעל את מתרגם ממוחשב קו עיכוב סריקה ולהמתין עד סריקת קו ההשהיה הושלמה. לבסוף, הגדר את מיקום קרן החפיפה המתקבל ואת קו העיכוב לרכישה הבאה של תמונות פיזור ראמאן מגורה. כדי לייעל את הסנכרון המרחבי של הקורות, התחל על ידי עצירת קרן ספיר טיטניום, והפחתת כוח OPO לשמונה מילי וואט.
לאחר מכן, חבר את קריאת הגלאי לכרטיס איסוף הנתונים. הפעל את תוכנית רכישת הנתונים יחד עם מסוף סריקת המיקרוסקופים. לאחר שתסיים, שמור את הקובץ ועבד את הנתונים כדי לקבל תמונה כמו זו המוצגת כאן.
לאחר מכן, עצרו את קרן OPO והפחיתו את כוח הספיר של טיטניום ל-2.5 עד 4.5 מילי-וואט. חבר את הגלאי עם מגבר הנעילה והקריאות שלו באמצעות כרטיס איסוף הנתונים. לאחר מכן, הפעל שוב את תוכנית רכישת הנתונים יחד עם מסוף סריקת המיקרוסקופים.
לאחר שתסיים, שמור את הקובץ ועבד את הנתונים כדי לקבל תמונה כמו זו המוצגת כאן. הצג ערימה של מסננים בין המטרה 40x ואת photodiode כדי להסיר את פולסים משאבה לרכוש רק את אות סטוק. לאחר מכן, להגדיר את אות המשאבה ל 810 ננומטר עם כוח ממוקד של שמונה מילי וואט.
הגדר את אות החללית ל-1076 ננומטר עם אותו כוח ממוקד של שמונה מילי-וואט כדי לחקור קשר פחמן-מימן טיפוסי של פוליסטירן עם תזוזת אמן של 3054 סנטימטרים הפוכים. חבר את הגלאי עם מגבר הנעילה וקריאת מגבר הנעילה לכרטיס איסוף הנתונים. לבסוף, הגדר את פורמט הפיקסל ואת זמן הרכישה בתוכנית המיקרוסקופ והפעל אותו ואת מערכת רכישת הנתונים, שמירת קובץ המטריצה לאחר השלמתו.
מדידת דוגמה מנקודה אחת של המדגם מוצגת כאן. כאשר הקרן אינה חופפת בזמן או בחלל, התוצאה המתקבלת היא תהודה כבויה, כאשר משרעת האות, כפי שהיא נמדדת על ידי מגבר נעילה, היא אפס. השלב של אות זה, לעומת זאת, קופץ בין ערכים שליליים וחיוביים.
אם הקורות חופפות בחלל, האות גדל ומגיע למקסימום כאשר הקורות חופפות באופן מושלם בזמן, בעוד השלב מתחיל להשיג ערך קבוע בזמן שבו הקורות חופפות. בתדמית שידור, נעשה שימוש בקרן אחת ועוצמת הקרן המשודרת מהדגימה נמדדת על ידי פוטודיודה. בצד שמאל, תמונת השידור הושגה באמצעות OPO, ואילו בצד ימין, תמונת השידור הושגה באמצעות טיטניום ספיר.
דוגמה אופיינית לתדמית SRS מוצגת כאן, שבה מדווחים תמונות ללא תווית של חמוזי פוליסטירן בקוטר של שלושה מיקרומטרים. על מנת לקבל תמונה באיכות גבוהה, המבוססת על מיקרוסקופ SRS, היישור של מיקרוסקופ הוא קריטי. לכן, כל הצעד המצוין בפרוטוקול צריך להתבצע בזהירות.
