בהדמיית Vivo של רקמות ביולוגיות עם רזולוציה תת-תאית וספציפיות כימית הוא כלי רב עוצמה להבנת התהליכים הדינמיים הכרוכים בחילוף החומרים התאי, התגובה החיסונית ושיפוץ הרקמות. עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה מגרה של ראמאן, ניתן לרכוש מידע ביוכימי וביופיזי קריטי של רקמות ביולוגיות מנקודות מבט מרובות עם רזולוציה תת-תאית. באופן ספציפי, מיקרוסקופיה דו-מודאלית זו יכולה לשמש לתמונה של דינמיקה תאית ואינטראקציות בחוט השדרה של העכבר כדי לחקור את ההתקדמות של מחלות ניווניות ופגיעה בחוט השדרה.
כדי להתחיל, להפעיל את לייזר ספיר טיטניום על ידי החלפת מתג המפתח מן המתנה למצב על ולחכות 30 דקות עבור הלייזר להתחמם. לאחר מכן הפעל את OPO על-ידי לחיצה על לחצן ההתחלה בלוח הבקרה של OPO והמתן 20 דקות עד שהלייזר יתחמם. לאחר שהלייזר picosecond מתחמם, בדוק את עומק האפנון של קרן סטוקס על ידי הורדת כוחה של קרן סטוקס לכ -20 מילי-וואט, פתיחת תריס הלייזר לקרן סטוקס והצבת גלאי צילום במהירות גבוהה בפלט OPO כדי לזהות את הקרן.
לאחר מכן, חבר את יציאת הפלט של הפוטדקטור ליציאת הקלט של אוסצילוסקופ באמצעות כבל קואקסיאלי עם מחבר BNC לניטור פעימת הלייזר. לאחר מכן פתח את חלון הבקרה של EOM בתוכנת בקרת OPO והתאם את העוצמה והפזה של EOM בהתאם לדיאגרמת עוצמת הדופק המוצגת באוסצילוסקופ כדי להשיג עומק אפנון מרבי של 20 מגה-הרץ. בתוכנת בקרת OPO, פתח את תריס הלייזר משאבה תוך עצירת פלט סטוקס.
לאחר מכן, לחץ על תיבת האות להגדיר כדי להגדיר את אורך הגל של קרן המשאבה ל 796 ננומטר, ולאחר מכן לחץ על תיבת הכוח OPO להגדיר ולהזין 20 כדי להגדיר את כוחה למינימום עבור יישור אופטי. לאחר מכן, הניחו את צלחת היישור P1 מאחורי מפצל הקרן המקטבת בכ -10 ס"מ ומניחים את הצלחת P2 מאחורי P1 בכ -30 ס"מ על הנתיב האופטי. לאחר פתיחת תריס המיקרוסקופ עבור קרן הלייזר picosecond, להתאים את המראה M1 כדי לאתר את מרכז קרן הלייזר picosecond בחור המעבר של P1. השתמש בטווח אינפרא-אדום כדי לבחון את מיקום נקודת הקרן ב- P1 בעת התאמת המראה M1. באופן דומה, התאם את המראה M2 כדי לאתר את מרכז קרן הלייזר של פיקוסונד בחור העובר של P2. השתמש בטווח האינפרא-אדום כדי לבחון את מיקום נקודת הקרן ב- P2 בעת התאמת המראה M2. לאחר התאמת המראות עד שמרכז הקרן של picosecond מאתר את החור העובר של שתי לוחות היישור, סגור את התריס של קרן picosecond בתוכנת בקרת המיקרוסקופ.
לאחר מכן, פתח את תריס המיקרוסקופ לקרן הלייזר הפמטו-שנייה. התאם את המראה M3 כדי לאתר את מרכז נקודת קרן הלייזר femtosecond בחור העובר של P1, ולאחר מכן להתאים את המראה M4 כדי לאתר את מרכז נקודת קרן הלייזר femtosecond בחור האחרון של P2. לאחר התאמת המראות עד שמרכז קרן הלייזר הפמטו-שניות מאתר את החורים העובריים של שתי לוחות היישור, סגור את תריס המיקרוסקופ עבור קרן הפמטו-שנייה. לאחר מכן, מקם מצלמה במיקום המטרה כדי לדמיין את המיקום של שני כתמי הקרן ולסמן את המיקום של קרן המשאבה על מסך המצלמה כהפניה.
לאחר מכן מקם לוח יישור P0 לפני העדשה L3 ולהתאים את המראה האופטית אחד באמצעות מקש כישוף, כך מרכז קרן סטוקס עובר את החור העובר של צלחת היישור ביציאת יציאת לייזר. השתמש בטווח האינפרא-אדום כדי לאשר את מיקום נקודת הקרן ב- P0 במהלך ההתאמה. לאחר מכן, להסיר את לוח היישור P0 ולהשתמש במקש כישוף כדי להתאים את המראה האופטית שתיים, כך מרכז קרן סטוקס co-לוקליזציה עם סימן הייחוס של קרן המשאבה על המצלמה.
המשיכו להתאים את המראות עד שקרן סטוקס תחפוף לחלוטין עם קרן המשאבה הן ב- P0 והן במישורי המצלמה. פתח את תוכנת בקרת המגבר הנעילה והגדר את אורך הגל של לייזר המשאבה ל -796 ננומטר ואת כוח המשאבה ואת קרן סטוקס ל -50 ו -70 מילי וואט המקבילים ל -15 ו -25 מילי וואט במדגם בהתאמה. לאחר מכן השתמשו בשמן זית לאופטימיזציה של שלב המגבר.
שמן הזית אטום בשקופית עם נייר טישו המחובר לתחתית כדי לשפר את פיזור האות בחזרה או זיהוי EPI-SRS. מניחים את דגימת שמן הזית על הבמה ומתאימים את המוקד של המטרה 25X על המדגם. באמצעות תוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר את פרמטרי ההדמיה כפי שצוינו בכתב היד של הטקסט.
לאחר מכן, באמצעות תוכנת בקרת מגבר הנעילה, הגדר את ערך קבוע הזמן ל- 10 מיקרו-שניות. לאחר מכן, לסרוק את קרן הלייזר מעל המדגם, כוונון השלב עם גודל צעד של 22.5 מעלות עד עוצמת האות SRS מגיע למקסימום. לאחר מכן סרוק את המדגם עם תריס הלייזר סגור, כוונון ערך ההיסט עם גודל צעד של מיליוולט אחד עד אות SRS הממוצע קרוב לאפס.
לאחר מכן, פתחו את תיבת הדו-שיח של מנהל ההשהיה בתוכנת הבקרה של OPO וסרקו את שמן הזית, תוך כוונון שלב ההשהיה עד שאות SRS של שמן הזית יגיע למקסימום. לאחר מכן הפסק את הסריקה ולחץ על לחצן הוסף נתונים בתיבת הדו-שיח מנהל ההשהיה כדי להקליט את נתוני ההשהיה הנוכחיים. לאחר שנרכש באופן דומה נתוני עיכוב במשמרות ראמאן שונות על ידי הדמיית דגימות כימיות שונות, בחר את התאמת הנתונים לפי סדר חמש בתיבת הדו-שיח של מנהל העיכובים כדי להתאים את נקודות הנתונים הנוכחיות לפונקציה הפולינומית מסדר חמישי.
לאחר מכן החל את הנתונים המותאמים על-ידי לחיצה על לחצן השימוש כלחצן מותאם אישית ובדיקת תיבת הסימון. שלב ההשהיה מותאם אוטומטית באורכי גל שונים בהתאם לעקומת ההשהיה המותאמת. להדמיית vivo, תקן את העכבר בשלב הייצוב עם חוט השדרה שלו חשוף ושקוע מלוחים.
כעת הרם את שלב הייצוב על שלב חמישה צירים מתחת למיקרוסקופ TPEF-SRS. לאחר מכן אבטחו את ראש העכבר עם שני מוטות ראש והורידו את לוח ההחזקה כדי להציע מספיק מקום לתנועת החזה במהלך הנשימה, תוך הקלה על ממצאי תנועה. לאחר מכן, התאם את שלב התרגום Z כדי לכוונן את המוקד עד שניתן יהיה לצפות בתמונת ברייטפילד של כלי הדם של חוט השדרה תחת מטרה של פי 10.
אתר את וריד הגב של חוט השדרה במרכז שדה הראייה על ידי כוונון השלב התרגומי הדו-צירי של שלב חמשת הצירים. לאחר מכן, כוונן את זוויות הגליל וההגשה של שלב חמשת הצירים כדי להתאים את משטח הגב של חוט השדרה בניצב לציר המטרה בהתבסס על התמונה של ברייטפילד. לאחר מכן החליפו את ה-10X במטרה טבילת מים פי 25 להדמיית TPEF-SRS.
להדמיית SRS, בחר את מפצל הקרן המקטבת מעל המטרה על-ידי לחיצה על כפתור המתג המחובר לסנפיר הממונע. להדמיית TPEF, בחרו את המראה הדיכרואית D2 מעל המטרה על-ידי לחיצה על כפתור המתג המחובר לסנפיר הממונע. לבסוף, הגדר את פרמטרי ההדמיה כמתואר בכתב היד של הטקסט והתחל לסרוק את המדגם.
בהדמיה דו-מודאלית של אקסונים YFP בעלי תווית דלילה ועטיפות מיאלין בחוט השדרה של העכבר, התברר כי האקסונים עטופים היטב בשכבה עבה של נדן מיאלין. כפי שניתן לראות בתמונת חוט השדרה TPEF-SRS, הצמתים של Ranvier ירדו קוטר האקסוני ואת האקסילמה נחשפת ישירות מטריצה חוץ תאית. בשילוב עם בדיקות חדשות עבור פלואורסצנטיות ו- SRS הדמיה שני פוטונים נרגש פלואורסצנטיות SRS מיקרוסקופיה יכול להשיג הדמיה מבנית ותפקודית בו זמנית של ביומולקולות שונות, להקל על ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים מורכבים.
