עבודה זו מומנה על ידי הפרס NSF DBI 0852891. חלק מהעבודה זה גם מומן על ידי המרכז Biophotonics מדע וטכנולוגיה, המיועד NSF המדע והטכנולוגיה מרכז המנוהל על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, על פי הסכם שיתופית מס &#39;PHY0120999.

1. הטיפול חייב להילקח חלק בהכנת והנחת מדגם ראמאן בתוך המערכת הזאת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיוון שהמערכת בדרך כלל עושה שימוש מאוד גבוה מטרות הצמצם המספרי עם מרחקים עבודה קצר מאוד, דגימות ממוקמים על coverslip. דגימות ביולוגיות מונחות בדרך כלל על coverslip 1 עובי מספר רכוב בתא תא Attofluor (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות נוזלי, במיוחד אלה רעילים לבני אדם, ממוקמות בתוך בקבוק זכוכית קטן עם coverslip ביצרו לפתיחת באמצעות אפוקסי סיליקון. הבקבוק הוא הפוך אז למדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכיוון שהמערכת שלנו תלויה בתזמון מדויק של המשאבה וקטניות האות, אנחנו מוגבלים לא להשתמש הסתגלות להתמקד קונבנציונאלי של המיקרוסקופ שלנו, המתרגמת את המטרה למעלה ולמטה. זה מוסיף גורע נתיב אופטי מהמערכת שלנו. במקום זאת, אנו מקום דגימות שלנו על הבמה המשנית רכוב על גבי הבמה מיקרוסקופ כי יש להתמקד שליטה עצמאית משלו. </li></ol> 2. על מנת לקחת זמן מגודרת ספקטרום ראמאן, הקורה עירור צריכים להיות מוכנים כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מתחילים עם האור העולה מתוך 2.4 W מתכונן פעמו טי: Sapph לייזר (Chameleon, מערכות קוהרנטית, סנטה קלרה, קליפורניה). כל הדופק הרכבת 80 הדופק MHz יש 30 NJ של אנרגיה, יש רוחב הזמני של fs 140, ויש לו מגוון מרוכז ב 808 ננומטר עם רוחב פס רפאים של ~ 6 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע חזרה מ-השתקפויות מחדש את חלל הכניסה הלייזר, האור עובר דרך המבודד פאראדיי. צלחת חצי גל להציב לפני המבודד פאראדיי מאפשרת כוונון רציף מכלל כוח שנשלח לתוך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כי 6 ננומטר הוא רחב מדי רוחב פס כדי לפתור מצבים ראמאן ביותר, קרן נשלחת דרך פילטר (0.8 ננומטר FWHM, אנדובר Corporation, סאלם, NH) צר מאוד bandpass מרוכז ב 808 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האור ממוקדת מכן על ידי כפיל אכרומטי (f = 100 מ&quot;מ) על borate β-בריום 5 מ&quot;מ (BBO) קריסטל (CASIX, פוז &#39;ו, Fujian, סין יח&quot;צ) לקצץ בחצי את אורך הגל של nm 808-404 ננומטר. גביש BBO ממוקם הר עם פקדי קצה ו להטות, ועלה גם על הבמה תרגום. כדי למקסם את יעילות ההמרה גל, גביש חייבים להיות ממוקמים בדיוק סימטרי על הפוקוס של כפיל, ועם ציר קריסטל שלה מיושר הקיטוב של הקרן הנכנסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל יעילות ההמרה של אורך הגל הוא תלויי קיטוב, שליטה על כמות האור נשלח המדגם ניתן להשיג על ידי הנחת צלחת חצי שנייה אחרי גל המבודד פאראדיי. על ידי החלפה זו waveplate, עוצמת האור נשלח המדגם יכול להיות מותאם באופן בלתי תלוי בעוצמת נשלח הקורה משאבה (שיידונו להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גל המרה האור הוא recollimated ידי כפיל אכרומטי השני (f = 500 מ&quot;מ) נבחר כך הקורה היציאה הוא גדול מספיק כדי למלא את הצמצם חזרה המטרה מיקרוסקופ, וביים לתוך מיקרוסקופ הפוכה (IX-71, אולימפוס, מרכז עמק, PA) באמצעות שתי מראות ההיגוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטרת מיקרוסקופ, להיות אלמנט אופטי שוכן בתוך רכיב מונוליטי ביותר של המערכת, מגדיר את ציר הראייה. כדי ליישר את הקורה עירור על הציר הזה, מראה ממוקם המטוס מדגם של המיקרוסקופ. שתי מראות ההיגוי הם אז מכוון iteratively תוך שמירה על גב משתקף קרן לייזר על מצלמת CCD-ERA (μEye, IDS, Obersulm, גרמניה) המחובר ליציאה הדמיה של המיקרוסקופ. בהנחה התמונה על המצלמה מתמקדת מיקרוסקופ שדה של נוף, הקורה על ציר כאשר את המקום מוקד מרוכז על השבב מיקרוסקופ ותרגום המטרה לאורך ציר Z-אינו משנה את נקודת המרכז הקורה ממוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר דגימת ממוקם המטוס מדגם מוקרן עם פיזור אור לייזר ראמאן מתרחשת. מסנן dichroic הניח מתחת למיקרוסקופ המטרה מפריד את אורך הגל, העביר אור מפוזר ראמאן (ו פלואורסצנטי) מן הקורה עירור, לכוון את אור מפוזר ראמאן לנמל בצד של המיקרוסקופ. המיקרוסקופ שונה כדי להסיר עדשות בתוך הנתיב הזה, כך עולה מן האור האות המיקרוסקופ collimated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכיוון קרן אות העולה מתוך המיקרוסקופ הוא גדול יותר מאשר הצמצם ברורה של מקטבים Glan-תומפסון, טלסקופ 0.47x בנוי משני כפילויות אכרומטי (F1 = 75 מ&quot;מ, F2 = 35 מ&quot;מ) משמש כדי לכווץ את הקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אור מקוטב האות מכן על ידי מקטב Glan-תומפסון בכיוון ב 0 ° ביחס אנכי בתוך מסגרת במעבדה, וניהל למראה dichroic שבו הוא recombined עם קרן המשאבה. </li></ol> 3. על מנת השער האופטי כדי לפעול ביעילות שיא, יש להקפיד בהכנת הקורה משאבה (קר קרן) וכן. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדופק המשאבה מוגדל הראשון עם טלסקופ בנוי עם שתי כפילויות אכרומטי (F1 = 35 מ&quot;מ, F2 = 100 מ&quot;מ) כדי להתאים את גודלו הסופי של קרן את האות על ידי 0.35x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרן המשאבה לאחר מכן נשלחת לקו עיכוב מורכבת פריזמה זווית ישרה להציב על הבמה תרגום ליניארי כי יכול להיות מכוון, כדי להבטיח חפיפה הזמני של המשאבה וקטניות אות (כוונון שיידונו להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שורת עיכובים, קרן נשלחת באמצעות צלחת חצי גל ו מקטב בכיוון ב 45 ° ביחס אנכי בתוך מסגרת מעבדה. זה מבטיח את מצב הקיטוב הנכון של קרן המשאבה כאשר הוא מגיע בינוני קוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האור משתקף אז את ההיגוי של שתי מראות, אחת עם piezo חשמלי שולטת, המשמשים דק להתאים את המיקום של הקורה משאבה כזאת שהיא חופפת מרחבית עם קרן את האות. חפיפה מתקבל על ידי התבוננות המשאבה ואת הקורות אות בשני מקומות, אחד קרוב אחד רחוק מן המראה dichroic שבו קורות משולבים. באמצעות המראה ההיגוי הראשון חפיפה שתי הקורות בשלב הקרוב, את המראה piezo חפיפה קורות בנקודה רחוקה, קרן המשאבה יכול להתבצע בדיוק קוליניארי עם קרן את האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שתי הקורות גם יחד, השער קר ומערכת איסוף מוגדרים על מנת למקסם את הזמן מגודרת שנאספו האות. </li></ol> 4. עם שתי הקורות גם יחד, השער קר ומערכת איסוף מוגדרים על מנת למקסם את הזמן מגודרת שנאספו האות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות המשאבה ואת האות הם עברו תחילה דרך פילטר dichroic כי יש מנת יתר של 6 ב 404 ננומטר למנוע אור עירור שיורית מתוך פיזור ראמאן מרגש בתוך המדיום ליניארית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשאבה וקורות אות ואז הם שניהם התמקדו על ידי כפיל אכרומטי (f = 35 מ&quot;מ) לתוך קובט 1 ס&quot;מ pathlength קוורץ המכיל את החומר ליניארית. כל חומר בעל קוי מדד כראוי קוי גבוה (גבוה מ CS 2), בתגובה הזמני קצר כראוי (&lt;2 ps), יכול להיות מנוצל כאן. בניסויים אלה, אנו משתמשים פחמן דיסולפיד, CS 2, כי יש מדד קוי n 2 = 3.1 x 10 -18 מ &#39;2 / W. האור recollimated מכן על ידי כפיל שנייה עם אורך מוקד זהה לראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורות הם עברו אז דרך Glan-תומפסון מנתח על הר מסתובב, ולאחר מכן באמצעות מערכת של מסנני קליטה הפרעה בשילוב יש OD של 10 ב 808 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לאור אות הוא התמקד על ידי כפיל אכרומטי (f = 35 מ&quot;מ) לתוך סיב אופטי multimode 50 מיקרומטר, כאשר הוא רכוב סיבים בשלב המאפשר תרגום x, y, וז&#39; סיבים מצמידים מכן הספקטרוגרף הדמיה מסחרי עם המצורפת מצלמת CCD (SP2300i ו Pixis 100B, בהתאמה, שניהם מיוצרים על ידי פרינסטון מכשירים, טרנטון, ניו ג&#39;רזי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליישר את מערכת איסוף על מנת למקסם את האות שנאספו, הנתח הוא 0 ° ו מדגם הבדיקה של טולואן ממוקם המטוס מדגם. על ידי התאמת x, y, z בקרות ההר סיבים, האות ראמאן נאסף הוא מותאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח חפיפה במרחב ובזמן הנכון של המשאבה וקורות האות, מראה ממוקם המטוס מדגם של המיקרוסקופ. המסנן 404 ננומטר הוא הסיר מהמערכת. עם הנתח כדי לסובב 90 ° ננומטר retroreflected קרן 404 נשלח אל הספקטרוגרף עם עוצמת מותאם כאלה שזה לא להרוות את המצלמה. עם הקורה משאבת כבוי, הנתח הוא הסתובב כדי למזער ננומטר האות המועבר 404. עם קרן משאבת חזר על, בשלב עיכוב מכוון לאט עד לסיום השידור של אור 404 ננומטר מתחיל לעלות. ואז, על ידי iteratively כוונון השלב דיחוי, את המראה piezo חשמלי, ואת x, y, z בקרות של סיבים, אחד ממקסם את האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכיוון רטרו משתקף 404 ננומטר קרן אור מפוזר ראמאן עשוי להימשך נתיבים שונים במקצת באמצעות המערכת, התאמות הסופי מבוצעים על ידי הצבת חזק ראמאן scatterer (כגון טולואן) על הבמה מדגם ואת tweaking מעט יישור על ידי שינוי שלב עיכוב, piezeo חשמלי במראה, ו-x, Y ו-Z שולט של סיבים כדי לייעל את האות ראמאן. </li></ol> 5. אוסף של ספקטרום זמן מגודרת אחת ראמאן דורש רכישת ספקטרום כמה לתקן חפצים המערכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הנתח מוגדר 0 °, קרן עירור על הקורה ואת משאבת כבוי, ספקטרום &quot;ungated&quot; היא נלקחה, המייצגים את הקשת זה יהיה רכש ללא היתרון של מערכת זמן gating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הנתח מוגדר ° 90, את קרן עירור ואת קרן משאבת עדיין כבוי, ספקטרום גב הקרקע נלקחת, המייצג את כמות האור תועה דולף דרך מקטבים ורכיבים אחרים במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הנתח הנותר על 90 °וכל הקורות על, את הספקטרום &quot;מגודרת&quot; היא נלקחה, המייצג את אור מפוזר ראמאן מותר דרך מקטבים חצו על ידי נוכחות של הקורה המשאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, עם הנתח עדיין 90 °, הקורה עירור לסירוגין את קרן על המשאבה, ספקטרום הרקע השני הוא נלקח, המייצג את התרומה הספקטרום &quot;מגודרת&quot; כמויות שיורית של אור 808 ננומטר נכנסים הספקטרוגרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, קשת נלקח עם כל לייזרים כבוי, המאפיינת את הבסיס האות &quot;כהה&quot; ברמה של המצלמה ואלקטרוניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל הספקטרום לעיתים קרובות דורשים פעמים אינטגרציה ארוך, הכרחי לשבור הפעם להשתלבות כמה חתיכות (מסגרות), כדי לאפשר תיקון נאותה של קרניים קוסמיות - בעיה נפוצה כאשר רכישת נתונים על תוחלת של מספר דקות. </li></ol> 6. רכשה פעם, מדרגות עיבוד כמה מועילים כדי לשפר את האיכות והמראה של הנתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, כל הספקטרום מתוקנות כהה על ידי הפחתת את ספקטרום &quot;כהה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את הקרניים הקוסמיות, המסגרות מספר המהווה one רכישת מושווים זה לזה על בסיס פיקסל אחר פיקסל. עבור כל פיקסל של מסגרת כלשהי נופל החוצה של 2 סטיות חציון מהערך החציוני פיקסל כי על פני כל המסגרות, ערך של פיקסל מוחלף על ידי הערך החציוני על פני כל המסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסגרות הקרינה הקוסמית תיקן הם ממוצעים אז והחליקה על ידי מסנן Savitzky-Golay 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ את ספקטרום &quot;נכון&quot; מגודרת, אנו לנכות את &quot;עירור בלבד&quot; ו &quot;משאבת בלבד&quot; ספקטרה מן הספקטרום נמדד מגודרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, ספקטרה מגודרת ו ungated אז הם הרקע לתיקון על ידי הפחתת 5 th סדר פולינום, נקבע בשיטה של ליבר Mahadevan ו-Jansen 2. </li></ol> 7. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תרשים סכמטי של מערכת gating קר. נתיב קרן משאבת מוצג באדום, ואילו נתיב SHG מוצג בכחול. הנתיב שבו רמן פלואורסצנטי הן חפפו מוצג בירוק, ואילו הנתיב בו Fluorescence סוננה temporally החוצה מוצג בצהוב. קיצורים כדלקמן: BPF, הלהקה לעבור סינון, CCD, מצמידים מכשיר חיוב; DCM, dichroic במראה; FI, פאראדיי מבודד; λ / 2, גל צלחת וחצי, LPF, ארוך לעבור מסנן: בינוני NLM, קוי, P, מקטב ; SHG, הדור השני הרמוני קריסטל. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2 למעלה:. ספקטרה גולמי של coumarin מומס בשמן טבילה. עקומת האדום מראה את ספקטרום שצולמו עם השער החזיק פתוח (מנתח מערכת להעברת מקסימום). עקומת שחור מראה ספקטרום שצולמו עם הנתח מיושר להעברת מינימום משאבה קרן מיושם (הספקטרום מגודרת). עקומת הכחול מראה את spectum שצולמו עם הנתח מיושר להעברת מינימלית ולא משאבת קרן מיושם (השער החזיק סגור). עקומת גרין מציג את ספקטרום שצולמו רק את הקורה משאבת מיושם. קווים מקווקווים מציינים מגנטה באזור ספקטרלי המוצגים בלוח להלן. כל ספקטרום להיות מוחלק עם נקודה 11, 3 Savitzky-Golay כדי לסנן. למטה: ספקטרה של coumarin מומס בשמן טבילה לאחר הקרינה רקע חיסור. עקומת האדום הוא הספקטרום עם השער החזיק פתוח, עקומת כחול הוא ספקטרום מגודרת. הספקטרום מגודרת מראה בבירור את מאפיין מפותל גבוהה wavenumber שיא של שמנים.

<ol>
	<li>Savitzky, A., Golay, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothing+and+differentiation+of+data+by+simplified+least+squares+procedures.">Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures.</a> Analytical Chemistry. 36, 1627-1639 (1964).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Gniadecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+diagnosis+by+Raman+spectroscopy+and+neural+networks:+Structure+alterations+in+proteins+and+lipids+in+intact+cancer+tissue.">Melanoma diagnosis by Raman spectroscopy and neural networks: Structure alterations in proteins and lipids in intact cancer tissue.</a> Journal of Investiga-tive Dermatology. 122, 443-449 (2004).</li><li>Lieber, C. A., Majumder, S. K., Billheimer, D., Ellis, D. L., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy+for+skin+cancer+detection+in+vitro.">Raman microspectroscopy for skin cancer detection in vitro.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 024013-024013 (2008).</li><li>Chen, K., Qin, Y., Zheng, F., Sun, M., Shi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+colorectal+cancer+using+Raman+spectroscopy+of+laser-trapped+single+living+epithelial+cells.">Diagnosis of colorectal cancer using Raman spectroscopy of laser-trapped single living epithelial cells.</a> Optics Letters. 31, 2015-2017 (2006).</li><li>Chan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+identification+of+individual+leukemia+cells+by+laser+trapping+Raman+spectroscopy.">Nondestructive identification of individual leukemia cells by laser trapping Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 80, 2180-2187 (2008).</li><li>Zhu, Q. Y., Quivey, R. G., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+bacterial+concentration+fractions+in+polymicrobial+mixtures+by+Raman+microspectroscopy.">Measurement of bacterial concentration fractions in polymicrobial mixtures by Raman microspectroscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 9, 1182-1186 (2004).</li><li>R&#246;sch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxonomic+identification+of+single+bacteria+by+micro-Raman+spectroscopy:+Application+to+clean-room-relevant+biological+contaminations.">Chemotaxonomic identification of single bacteria by micro-Raman spectroscopy: Application to clean-room-relevant biological contaminations.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 1626-1637 (2005).</li><li>Moritz, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopic+signatures+of+the+metabolic+states+of+escherichia+coli+cells+and+their+dependence+on+antibiotics+treatment.">Raman spectroscopic signatures of the metabolic states of escherichia coli cells and their dependence on antibiotics treatment.</a> Biophysical Journal. 98, 742a-742a (2010).</li><li>Dehring, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+chemical+changes+in+subchondral+bone+taken+from+murine+knee+joints+using+Raman+spectroscopy.">Identifying chemical changes in subchondral bone taken from murine knee joints using Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 60, 1134-1141 (2006).</li><li>Berger, A. J., Koo, T. W., Itzkan, I., Horowitz, G., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+blood+analysis+by+near-infrared+Raman+spectroscopy.">Multicomponent blood analysis by near-infrared Raman spectroscopy.</a> Applied Optics. 38, 2916-2926 (1999).</li><li>Qi, D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+concentration+measurement+in+blood+serum+and+urine+samples+using+liquid-core+optical+fiber+Raman+spectroscopy.">Chemical concentration measurement in blood serum and urine samples using liquid-core optical fiber Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 46, 1726-1734 (2007).</li><li>Beier, B. D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+automated+background+subtraction+from+Raman+spectra+containing+known+contaminants.">Method for automated background subtraction from Raman spectra containing known contaminants.</a> The Analyst. 134, 1198-1202 (2009).</li><li>De Luca, A. C., Mazilu, M., Riches, A., Herrington, C. S., Dholakia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy.">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 738-745 (2010).</li><li>Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 16807-16812 (2005).</li><li>Jones, W. J., Stoiche, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+raman+spectra:+Induced+absorption+at+optical+frequencies.">Inverse raman spectra: Induced absorption at optical frequencies.</a> Physical Review Letters. 13, 657-659 (1964).</li><li>Freudiger, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+et+Imaging+with+High+Sensitivity+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Label-Free et Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Cui, M., Bachler, B. R., Ogilvie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+coherent+and+spontaneous+Raman+scattering+under+biological+imaging+conditions.">Comparing coherent and spontaneous Raman scattering under biological imaging conditions.</a> Optics Letters. 34, 773-775 (2009).</li><li>Matousek, P., Towrie, M., Stanley, A., Parker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rejection+of+fluorescence+from+Raman+spectra+using+picosecond+Kerr+gating.">Efficient rejection of fluorescence from Raman spectra using picosecond Kerr gating.</a> Applied Spectroscopy. 53, 1485-1489 (1999).</li><li>Matousek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+suppression+in+resonance+Raman+spectroscopy+using+a+high-performance+picosecond+Kerr+gate.">Fluorescence suppression in resonance Raman spectroscopy using a high-performance picosecond Kerr gate.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 32, 983-988 (2001).</li><li>Knorr, F., Smith, Z. J., Wachsmann-Hogiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+time-gated+system+for+Raman+spectroscopy+of+biological+samples.">Development of a time-gated system for Raman spectroscopy of biological samples.</a> Optics Express. 18, 20049-20058 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תחום ספקטרוסקופיית ראמאן ביו ראה עניין גובר בשנים האחרונות כתוצאה פוטנציאל הפגינו שלה לפתרון האתגרים הקשים מספר אבחון ביולוגי. לדוגמה, ספקטרום ראמאן הוכחו יש ערך אבחון סרטן זיהוי 3, 4, 5, 6. ספקטרוסקופיית ראמאן שימש גם ב quantitation חיידקי 7, 8 ו 9 תגובה התרופ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> עדשות </td><td> ThorLabs </td><td> שונים </td><td> כל עדשות מצופה יש הפסדים השידור המרבי של 1% כל אחד </td></tr><tr><td> מתכוונן טי: Sapph לייזר </td><td> קוהירנט </td><td> זקית </td><td> 30 ניו ג&#39;רזי, 200 fs, 80 MHz </td></tr><tr><td> שמן 40X טבילה אובייקטיבי </td><td> אולימפוס </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1.35 </td></tr><tr><td> הפוך מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> IX-71 </td><td> השתנה כדי להסיר את כל עדשות בנמל צד </td></tr><tr><td> חצי צלחת גל </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> Glan-תומפסון מקטב </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ העברת 10% הפסד </td></tr><tr><td> ספקטרומטר </td><td> PI אקטון </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI אקטון </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Mathmatical תוכנה </td><td> MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> גרסת 2008a </td></tr><tr><td> פאראדיי מבודד </td><td> EOT </td><td> BB8-י 5 </td><td></td></tr><tr><td> Piezo חשמלי המראה </td><td> ניופורט </td><td> AG-M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO קריסטל </td><td> CASIX </td><td> מנהג </td><td> 1 מ&quot;מ עובי </td></tr><tr><td> Bandpass לסנן 1 </td><td> אנדובר </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0.4 ננומטר </td></tr><tr><td> Dichroic במראה </td><td> Semrock </td><td> FF662-FDI01 </td><td> הלהקה קצה ב 662 ננומטר </td></tr><tr><td> ארוך לעבור סינון </td><td> Semrock </td><td> BLP01-405R </td><td> הלהקה קצה ב 417 ננומטר </td></tr><tr><td> Bandpass לסנן 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 ננומטר </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 335266 </td><td> 99% טוהר </td></tr><tr><td> Coumarin 30 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 546127 </td><td> 99% טוהר </td></tr><tr><td> טבילה שמן </td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td> סוג DF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

ספקטרוסקופיית ראמאן היא סובלת לעתים קרובות על ידי רקע פלורסנט חזקה, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות. אם המדגם הוא נרגש עם רכבת של פולסים מהירים, מערכת שיכולה temporally נפרד spectrally חופפים אותות על picosecond זמנים יכולים לבודד מיד מגיע אור מפוזר ראמאן מן האור המגיע מאוחר פלואורסצנטי. כאן אנו דנים, הקמה ותפעול של מערכת מורכבת אופטית לא לינארית העושה שימוש כל אופטי מיתוג בצורה של צריכת חשמל נמוכה אופטי קר השער לבודד את האותות רמן פלואורסצנטי. לייזר יחיד 808 ננומטר עם 2.4 וואט בממוצע ו 80 חזרות בקצב MHz מפוצלת, עם mW כ 200 של אור 808 ננומטר להיות מומר 5 mW &lt;אור 404 ננומטר נשלח המדגם לרגש פיזור ראמאן. הנותרים unconverted אור 808 ננומטר לאחר מכן נשלחת בינוני קוי בו מעשים כמו משאבת עבור תריס כל אופטי. תריס נפתח ונסגר ב fs 800 עם יעילות שיא של כ -5%. באמצעות מערכת זו אנו מסוגלים להפריד בהצלחה אותות רמן הקרינה על שיעור 80 MHz החזרה באמצעות אנרגיות וכוחות הדופק הממוצע להישאר בטוחים מבחינה ביולוגית. כיוון שהמערכת אין לקיבולת במונחים של כוח אופטי, אנחנו מספר שיקולים פרט לעיצוב ויישור המסייעים למקסם את התפוקה של המערכת. כמו כן, אנו דנים פרוטוקול שלנו להשגת חפיפה במרחב ובזמן של האות וקורות המשאבה בתוך המדיום קר, כמו גם פרוטוקול מפורט לרכישת ספקטרלי. לבסוף, אנו דו&quot;ח תוצאות נציג כמה ספקטרום ראמאן שהושג בנוכחות הקרינה חזקה באמצעות מערכת זמן gating שלנו.

Watch this Scientific Journal Video about Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy at JoVE.com

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

אנחנו דנים הקמה ותפעול של מערכת מורכבת אופטית לא לינארית המשתמשת מיתוג מהירים כל אופטי לבודד ראמאן אותות הקרינה. באמצעות מערכת זו אנו מסוגלים להפריד בהצלחה אותות רמן הקרינה ניצול אנרגיות וכוחות הדופק הממוצע להישאר בטוחים מבחינה ביולוגית.

דחיית רקע הקרינה תהודה ו microspectroscopy ראמאן ספונטנית

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

rejection-fluorescence-background-resonance-spontaneous-raman

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Views.  University of California, Davis. אנחנו דנים הקמה ותפעול של מערכת מורכבת אופטית לא לינארית המשתמשת מיתוג מהירים כל אופטי לבודד ראמאן אותות הקרינה. באמצעות מערכת זו אנו מסוגלים להפריד בהצלחה אותות רמן הקרינה ניצול אנרגיות וכוחות הדופק הממוצע להישאר בטוחים מבחינה ביולוגית.

Video: Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...