פרוטוקול ההיתוך וההיתוך המפורט כאן הוא דרך יעילה לחקור חלבונים הקשורים לממברנה במודל של תערובת שומנים ושומנים על ידי חלבוני היתוך. כאן אנו מתארים התחדשות בסיוע חומר ניקוי של אטסטין דרוסופילה רקומביננטי, חלבון היתוך ER, לתוך ליפוזומים phosphatidylcholine מעוצב מראש. היתוך של פרוטאוליפוזום אטסטין נמדד לאחר מכן על ידי מוצף ערבוב שומנים מבוססי FRET.
אחד היתרונות העיקריים של התחדשות בסיוע חומר ניקוי הוא החלבון בחומרי ניקוי אינו חשוף לייבוש או ממסים. אנו גם מראים כאן כי אוריינטציה מחדש של אטסטין היא יעילה מאוד. יתרון נוסף של ההטעיה על ערבוב שומנים מבוסס FRET הוא שאין צורך להטעין את ליפוזומים בצבע כלשהו, ואין צורך בצעדי דיאליזה נוספים.
כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מניות תערובת השומנים בכלורופורם, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף microcurie אחד למיליליטר של DPPC לתערובות השומנים, הקפד לשמור לפחות שמונה microliters של מלאי זה. מעבירים את הכמות הרצויה של תערובת השומנים לצינורות זכוכית צור.
ואז לייבש את השומנים מתערבב תחת זרם עדין של גז חנקן במשך כ 10 דקות עד לא יותר כלורופורם גלוי. יבש את הסרט השומנים וכתוצאה מכך עוד יותר במייבש על ידי שאיבת אבק במשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו מספיק A100 עם 10%גליצרול, שני מילימולרים 2-mercaptoethanol, ו EDTA מילימולר אחד לסרט השומנים כדי להחזיר את הריכוז ל 10 מילימולר.
תדליק מחדש את סרט השומנים על ידי מערבולת קלה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להקפיא את השומנים hydrated בחנקן נוזלי. כדי להפשיר את ליפוזומים, תן תספורת לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות, ולאחר מכן להעביר אותם בחזרה למים להפשרה מהירה יותר.
חזור על מחזור הפשרת הקפאה זה בסך הכל 10 פעמים. לאחר מכן, להשתמש mini-extruder להעביר את השומנים דרך מסנני פוליקרבונט, עם גודל נקבובית של 100 ננומטר, 19 פעמים. כדי לקבוע את ריכוז השומנים הכולל של ליפוזומים, להוסיף ארבעה microliters של מלאי השומנים ו lysosomes לשלושה מיליליטר של קוקטייל scintillation.
למדוד את הספירות הממוצעות לדקה עבור מלאי ליפוזומים, ולחשב את ריכוז ליפוזום, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחסן את ליפוזומים בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. ראשית, מערבבים את הכמות המתאימה של חיץ, חומר ניקוי נוסף וחלבון בצינור של 0.5 מיליליטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
מוסיפים במהירות את ליפוזומים, ומיד מערבולת במשך חמש שניות כדי הומוגניזציה של התערובת. חממה התגובה במטורף בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. במהלך הדגירה הזו, שוקלים 0.2 גרם של בחנורי פוליסטירן ומעבירים אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה.
מוסיפים מיליליטר אחד של מתנול לצינור, ומערבבים במשך דקה אחת כדי לדגום את חרוזים. לאחר מכן, שאף את מתנול עם מחט 21-מד או גבוה יותר. כדי להתחיל לשטוף את החמרוזים, מוסיפים להם מים.
תן את חרוזים לערבב עם המים במשך חמש דקות, ולאחר מכן שאף את המים. חזור על תהליך שטיפת מים זה ארבע פעמים. לאחר מכן, להוסיף מים כדי להביא את תרחיף תריס פדירה פוליסטירן לנפח של מיליליטר אחד, עם ריכוז סופי של 0.2 גרם למיליליטר.
חשב את כמות חרוזי הפוליסטירן הדרושים כדי לספוג את כל חומר הניקוי בכל דגימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חותכים טיפ פיפטה כדי לאסוף את תרחיף חרוזים. מעבירים את הכמות המחושבת של תרחיף חרוזים לצינור 0.5 מיליליטר, ושואפים את המים.
מוסיפים את הדגימות לצינור המכיל את חרוזים, ודגירה במטורף בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. מעבירים את הדגימות לצינור טרי המכיל חרוזים חדשים, ומוודאים להשאיר את חרוזים ישנים מאחור. דגירה שוב באמצעות אותם תנאים.
חזור על תהליך זה של העברה ודגירה של חרוזים פעמיים. לאחר מכן, מעבירים את הדגימה לצינור חדש המכיל חרוזים טריים ודגירה על ידי אגוזים לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את המדגם מן חרוזים צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה אגרגטים חלבון מסיסים.
לשחזר את supernatant, ולקבוע את ריכוז השומנים הסופי על ידי ספירת נצנוץ נוזלי, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, להביא את התורם ואת proteoliposomes מקבל לריכוז של 0.15 מילימולר כל אחד ב A100 המכיל גליצרול, בטא-mercaptoethanol, EDTA, ומגנזיום כלורי. מעבירים כל תגובה ל הבאר בצלחת שטוחה של 96 באר המתאימה לקריאת פלואורסצנטיות, ומוודאים להכין לפחות ארבע תגובות, כולל שליש ושליטה שלילית ללא GTP.
מניחים את הצלחת לתוך קורא צלחת שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. למדוד את הפלואורסצנטיות NBD כל דקה במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף GTP חמישה מילימולר כדי לגרום היתוך.
למדוד את הפלואורסצנטיות NBD כל דקה במשך שעה אחת באמצעות אותה העירור וההפחתה כמו קודם. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של 2.5%n-Dodecyl בטא-D-maltoside ל הבארות כדי להמיס את proteoliposomes, ולמדוד את הפלואורסצנטיות NBD המרבי כל דקה במשך 15 דקות באמצעות אותה קריאה ו פליטה. במחקר זה, אטלסטין Drosophila רקומביננטי מטוהר ו מחדש לתוך ליפוזומים מעוצבים מראש.
היעילות של התחדשות אטסטין נקבעת על ידי פרוטאוליפוסמים צף מחדש ב iohexol הדרגתי לא רציפה. דגימות של השכבות ההדרגתיות העליונות, האמצעיות והתחתונות נקצרות ומנותחות על-ידי כתמי SDS-PAGE ו- Coomassie. כימות הג'ל על ידי densitometry מראה יעילות גבוהה מאוד של התחדשות עם הפסדים זניחים, עם 96% מכלל החלבון נמצא פרוטאוליפוזום שצף לשכבה העליונה.
פחות מ-1% מהחלבון אינו מפוסס ומימצאות בשכבה האמצעית, ורק 3% אינו מצטבר או מצטבר ומותן לשכבה התחתונה. האוריינטציה של אטסטין לאחר התחדשות הוא כימת על ידי מחשוף טרומבין מחשוף. דגימות מנותחות עם כתמי SDS-PAGE וקומאסי וממותמות על ידי צפיפות.
רוב החלבון המשוחזר הוא מחשוף, עם רק 7% להיות מוגן מפני פרוטאז. הקינטיקה והיקף ההיתוך הפרוטאוליפוזום בתתיווך אטלסטין מנותחים על ידי תיסים מערבבים שומנים. דגירה של חמש דקות מתבצעת לפני גרימת היתוך עם GTP בנקודת הזמן אפס.
לאחר שעה אחת, n-Dodecyl בטא-D-maltoside התווסף כדי לבודד את proteoliposomes ולקבל את שחרור העברת תהודה פלואורסצנטי מקסימלית. מקסימום ההיתוך בהפעלה נראה 11% של פלואורסצנטיות מקסימלית. שומנים מומסים בכלורופורם.
בעת הכנת השומנים מתערבב, הקפד לעשות זאת במהירות, על מכסה המנוע הכימי, ועל הקרח, כדי למנוע כל אידוי. ניתן לנתח פרוטאוליפוזום אטלסטין על ידי מיקרוסקופיה כדי לדמיין את ההשפעות של עוגן קרום על צורה liposome וגודל. שיטה זו הורחבה כדי ללמוד חלבונים אחרים מעוגן קרום וכיצד להתנהג bilayer השומנים מודל.
פרוטוקול זה משתמש שומנים titrated לכמת את תערובות השומנים. הקפד לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים בעת עבודה עם חומרים רדיואקטיביים.
