הפרוטוקול שלנו מאפשר בידוד והפרדת KRAS מעובד כראוי בתשואה גבוהה. הייצור של KRAS מנומנם אותנטי carboxymethylated מאפשר לבצע ניסויים שיש KRAS בקרום שלהם בדיוק כמו בתאי יונקים. התשואה הגבוהה של הפרוטוקול מבדילה אותו מעבודה קודמת.
בדרך כלל אנו מטהרים 3-5 מיליגרם חלבון לליטר חומר ביטוי. זה מאפשר לנו לערוך מגוון ניסויים ביולוגיים ביופיזיים ומבניים. KRAS מוטציה ב 20% של סרטן ו 90% בסרטן הלבלב.
אז לאחר פרוטוקול לייצר חלבון מעובד אותנטי הוא די שימושי לפיתוח מסכי סמים, כך שאתה יכול ללמוד את החלבון בפועל כפי שהוא יהיה על הממברנה של תאים סרטניים. פרוטוקול זה הוא גם מאוד שימושי לחקר חלבונים אחרים כי הם farnesylated מעובד באופן מלא בתאים. וככזה, כל מה שאתה צריך לעשות הוא להחליף את KRAS עם החלבון של עניין ולשים אותו לתוך baculovirus.
הצעדים הקריטיים הם אלה סביב כרומטוגרפיה חילופי הקטיון. שימוש בעמודה הנכונה והגבלת הזמן שבו החלבון נמצא במאגר מלח נמוך חיוניים להצלחה. ההבנה כי המשקעים אינם סוג של כדור שלג של אירוע מסייע להנחות את אלה חדשים לפרוטוקול.
זה מחוזק על ידי הצגת הצורך לחלק את עומס עמודת חילופי הקטינות לעומסים קטנים יותר מרובים. לאחר lysing תאים, הבהרת lysate, וטיהור חלבון היעד על ידי IMAC, לנתח את שברי החלבון באמצעות דף SDS וכתמים קומאסי. בריכת שברי השיא דיאליזה הבריכה לילה נגד שני ליטרים של חיץ D בארבע מעלות צלזיוס.
ביום שלמחר, להסיר את המדגם מדיאליזה צנטריפוגה אותו ב 4, 000 פעמים g במשך 10 דקות כדי להסיר כל משקעים. הדגימה הדיאליזה והמובהרת הסופית היא לעתים קרובות עדיין מעורפלת אך ניתן להחיל אותה על עמודת CEX ללא עיבוד נוסף. הכן 20 עמודת חילופי יון מיליליטר על ידי שטיפת אותו עם שלושה כרכים עמודה של חיץ G, ולאחר מכן עם שלושה כרכים עמודה של חיץ F.Next, לדלל 20 מיליליטר של המדגם דיאליזה לריכוז נתרן כלורי סופי של 100 מילימולר על ידי הוספת 20 מיליליטר של מאגר E ולהחיל את המדגם על עמודת החליפין.
זה קריטי לדלל את הכמות הקטנה של המדגם במקום בבת אחת ואת הדגימות מדולל צריך להיות מיושם על הטור מיד לאחר דילול כדי להגביל את המשקעים של החלבון. המשך לטעון את העמודה עם מדגם מדולל טרי כאשר הדילול הקודם מתקרב לסוף העומס. לאחר מכן שטפו את העמודה לספיגה בסיסית 280 עם מאגר F הדורש בדרך כלל שלושה אמצעי אחסון של עמודות.
החלף את החלבון מהעמודה עם שיפוע של 400 מיליליטר ממאגר F ל- 65%buffer G, ואסף את ה- eluent בשישה שברים מיליליטר. לאחר השלמת מעבר הצבע, המשך לשטוף את העמודה לקבלת אמצעי אחסון נוספים של 1.5 עמודות של 65%buffer G.בחר את השברים החיוביים המבוססים הן על דף SDS והן על ניתוח כתמים כחול קומאסי, כמו גם בדיקה של עקבות UV של הכרומטוגרמה. ואז לאסוף את החלבון ולעכל אותו עם פרוטאז TEV His6 על פי הוראות כתב היד.
לאחר העיכול והדיאליזה, העמיסו את החלבון על עמוד IMAC של 20 מיליליטר עם חיץ A ב-3 מיליליטר לדקה. לאסוף שבעה שברים מיליליטר במהלך כרומטוגרפיה זו ולשטוף את העמודה עם סך של שלושה כרכים עמודה של מאגר A או עד ספיגה בסיסית הוא הגיע. יש להניף את חלבון היעד עם שיפוע נפח של חמש עמודות של מאגר C מ-0% ל-10% ולאסוף שבעה שברים מיליליטר.
לאחר מכן זהה את השברים החיוביים באמצעות דף SDS. כאשר מנתחים אותו עם דף SDS, ה-lysate המובהר צריך להכיל רצועה כהה הנודדת אל כ-65 קילו-דלטון התואמת את חלבון ההיתוך His6-MBP-tev-KRAS4b. ה- FNTAb המובע במשותף עובר ל- 48 קילודאלטונים.
הצעד CEX בתוך הטיהור הוא קריטי כי זה מקטין את היקף פרוטאוליזה ומעשיר את החלבון מעובד במלואו, אבל הוא החלק המסובך ביותר של הפרוטוקול. תוצאה אופיינית של שלב זה יש שיא בולט שלוש עם KRAS4b-FMe אבל פרופילי אלוטיון יכול להיות משתנה. ניתוח מסה שלם באמצעות ESIMS לאשר את המסה המולקולרית המדויקת של החלבונים ובכך את החלק היחסי של farnesylation או carboxymethylation.
בעוד מגרשים סופיים טיפוסי הכיל כמה KRAS4b-FARN לזיהוי, שיעור זה היה פחות מ 15%במונחים של גובה שיא מניתוח זה. ניתוח מסה מקורי שימש כדי לקבוע את המסה של KRAS4b מחויב לתמ"ג. הממס לדוגמה הוחלף לאמוניום אצטט כדי להבטיח יינון רך יותר המאפשר למתחם המקורי להישאר שלם.
האינטראקציה של KRAS4b-FMe וליפוזומים נמדדה עם תהודה פלסמון פני השטח כדי לאמת את farnesylation ו carboxymethylation נדרשים KRAS4b-FMe להיקשר ממברנות. כצפוי, KRAS4b-FMe קשור ליפוזומים בעוד KRAS4b לא מעבד לא. צמצום הזמן שבו החלבון נחשף למלח נמוך הוא ההיבט הקריטי ביותר בפרוטוקול המשפיע על התשואה.
החלבון נמצא רק לזמן קצר בריכוז מלח נמוך זה בעקבות הדילול במאגר E.The החלבון יכול לשמש למגוון ניסויים ביופיזיים המשתמשים בפנטומימה של קרום כמו ליפוזומים או ננו-דיסקים כדי לחקור עם אילו שומנים KRAS מקיים אינטראקציה. באמצעות נתונים אלה, אנו יכולים להתחיל לשער כיצד KRAS אינטראקציה עם קרום הפלזמה של התא. באמצעות KRAS-FMe מטוהרים, עמיתינו הצליחו לפתור את מבנה גבישי הרנטגן של KRAS במתחם עם מלווה ספציפי לצורה המטופה והמתילציה של חלבון זה.
