שינוי לימפוציטים הוא מאפיין חשוב של כל תגובה חיסונית. לכן, פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה מאפשר לחוקר להעריך את הניידות של לימפוציטים במערכת במבחנה מוגדר היטב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי כימוקינים שונים ניתן להעריך כדי לקבוע את האפקטיביות שלהם של גרימת הגירה בתאים שהוגדרו לאחרונה, כגון הקבוצה שני תאי לימפה innate, או ILC2.
יתרון שני הוא כי מעכבים או טיפולים ביולוגיים שמטרתם חסימת מסלולי כימוקין מסוימים עשויים להיבדק על ידי שיטה זו לפני ביצוע ניסויים יקרים יותר עם בעלי חיים. התחל על ידי כריתת ריאות ותולים מעכברים זכר ונקבה שטופלו ביציות המתת דם באמצעות שניים עד שלושה בעלי חיים לכל קבוצה. מניחים רקמות excised בצינורות דיסוציאציה נפרדים על פי סוג הרקמות ומין בעלי חיים.
מניחים את רקמת הריאה ב 500 microliters של מדיה דיסוציאציה ריאות בצינור דיסוציאציה, למקם את הצינור דיסוציאטור רקמות אוטומטי, ולנתק אותו באמצעות פרוטוקול הריאות. חזור על שלבים אלה במשך שתי פעמים בסך הכל. כדי לנטרל רקמת טחול, מקם אותה ב- 500 מיקרוליטרים של מדיה מלאה של RPMI בדיסוציאטור ולאחר מכן השתמש בפרוטוקול הטחול.
עובדים בארון בטיחות ביולוגי בטכניקה סטרילית מעתה והלאה, מסננים כל רקמה ניתוק דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר, ולאסוף לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר. לשטוף את צינורות דיסוציאציה המכיל הומוגניטים ריאות עם חמישה מיליליטר של מדיה נוספת דיסוציאציה ריאות, צינורות המכילים homogenates טחול עם חמישה מיליליטר של RPMI מלא, ולסנן את התוכן שלהם דרך המסננים המשמשים עבור הרקמות המתאימות שלהם. כדי לנטרל עוד יותר את רקמת הריאה, הדגירה הומוגנית ריאות במשך 15 עד 30 דקות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני.
לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של RPMI מלא הן לריאות והן להומוגניטים הטחולים, ולצנטריפוגה. לאחר השלכת העל-טבעי, שלב את כדורי המכילים טחול ותאי ריאות מקבוצה של בעלי חיים מאותו המין לתוך צינור חרוט יחיד 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של RPMI מלא לכל צינור, ולתלות מחדש.
קבע את ספירת התאים הכוללת באמצעות מונה תאים אוטומטי. התאם את המתלים של תאים זכריים ונוריים ל-100 מיליון תאים למיליליטר במאגר ההפרדה, ולאחר מכן הוסף לצינור פוליסטירן של חמישה מיליליטר. לאחר בידוד קבוצה שני תאי לימפואידים innate מ 2/3 של התאים הכולל כמתואר בכתב היד, להשתמש בתאים הנותרים עבור הליך בידוד תא T חיובי CD4.
כדי להתחיל בידוד תאי T חיובי ל- CD4, הוסף סרום עכברושים להשעיית העשרת תאי CD4 T. לאחר מכן מוסיפים קוקטייל בידוד לדגימה הסלולרית, ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדורים מהירים של מערבולת למשך 30 שניות, ומוסיפים לדגימה התאית כדי להשיג דילול של 75 מיקרוליטר למיליליטר.
מערבבים בעדינות, ו דגירה במשך 2 1/2 דקות בטמפרטורת החדר. מעל הדגימות עם כשני מיליליטר של חיץ הפרדה עד שלושה מיליליטר, מניחים את הצינורות חמישה מיליליטר לתוך שמונה תאים מגנט הפרדה קלה, ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. ואז להטות את המגנט קדימה, ו pipette כל מתלה תא לתוך צינור חמישה מיליליטר נקי.
הוסף 1.5 מיליליטר של RPMI ללא סרום לכל צינור, וצנטריפוגה. יוצקים את supernatant, ולתלות מחדש את גלולת תא T חיובי CD4 ב 10 מיליון תאים למיליליטר ב RPMI ללא סרום. כדי להתחיל בחלק זה של הפרוטוקול, קבע את מספר המוסיףים של Transwell הדרושים לניסוי הן עבור תאי ILC2 והן עבור תאי T חיוביים ל- CD4 כמתואר בכתב היד.
הזז בעדינות שלושה מיקרון טרנסוול מוסיף מהשורות האמצעיות של צלחת 24 באר לשורות העליונות והתחתונות של אותה צלחת 24 באר עם קצה פיפטה וידיים כפפות. הוסף 500 microliters של מדיה הגירה עם CCL17 כדי 1/3 של בארות בשורה האמצעית של צלחת 24 באר. הוסף 500 מיקרוליטרים של מדיה הגירה עם CCL22 לעוד 1/3 של בארות.
ולבסוף, להוסיף 500 microliters של RPMI ללא סרום המכיל שום כימוקין האחרון 1/3 של בארות. סמן את המכסה על הצלחת בבירור בשם המדיה המתאימה להתגלות הממוקמת בארות התחתונות. לאחר מכן, מניחים את טרנסוול מוסיף בחזרה לתוך בארות המכילות את הטיפולים השונים.
הוסף בעדינות 100 מיקרוליטרים של תאי CD4 T או ILC2 ל הבאר העליונה של כל הכנס, הקפד לא לערבב או לפעום את ההשעיה של התא למעלה ולמטה בטרנסוולים. סמן את המכסה על הלוח בבירור כאשר סוג התא ממוקם בכל באר, וכתוב את התאריך והשעה ביום שבהם נוספו התאים. חזור על תהליך זה החל מהסרת הוספות Transwell מהלוח עד שכל התאים ימוקמו בטרנסוול מוסיף עם מדיה.
לאחר התאים של עניין מבודדים, הצעדים החשובים ביותר הם לעקוב אחר כימוקינים וסוגי תאים הממוקמים בארות מסוימות, בעדינות להוסיף תאים לתאים העליונים, ולאחר מכן כדי למנוע מגע מיותר עם צלחת שינוי צורה במהלך הדגירה 48 שעות. מניחים בעדינות את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, וחגירה למשך 48 שעות, ומוודאים למזער את המגע עם הצלחת לאורך תקופת הדגירה. לאחר הסרת הצלחת בעדינות מהחמה, הסר את כל מוסיף Transwell מהשורות האמצעיות לתוך הבארות הריקות ממש מעל או מתחת.
אסוף את התאים מה בארות העליונות והתחתונות של הוספות Transwell לצינורות המסווים בחלק העליון או התחתון עם CCL17, CCL22 או מדיה, עם סוג התא ועם מספר השכפול. לשטוף את בארות התחתון עם 500 microliters של 1x PBS, לאסוף אותו לתוך הצינורות המתאימים, ולעשות את אותו הדבר עבור בארות העליון. צנטריפוגה הצינורות ב 378 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
השתמש פיפטה כדי להסיר בעדינות את כל supernatant, ולאחר מכן resuspend תא T ו כדורי ILC2 עם 50 microliters של 1x PBS. לאחר הסרת 10 microliters של ההשעיה התא, להוסיף 90 microliters של 0.4% trypan כחול. ספור את התאים ב מונה התאים האוטומטי.
ועל כל מדגם, אחוז שיא של כדאיות וספירת תאים למיליליטר, ולקבוע את המספר הכולל של תאים לכל טיפול בחלק העליון והתחתון. כאשר ביטוי CCR4 הוערך הן בתאי T חיוביים ל- CD4 והן ב- ILC2 על-ידי ציטומטריית זרימה, לא היו הבדלים בין מארחים זכריים ונוריים. עם זאת, הביטוי של CCR4 על בסיס לכל תא על ILC2 היה גבוה יותר בהשוואה לתאי T חיוביים CD4.
כאשר התא התחתון של מנגנון Transwell היה מלא במדיה לא מטופלת של תרבות תאים, מדיה המכילה CCL22, או מדיה המכילה CCL17, פחות מ - 14% מהתאים הועברו בתנאי בקרת מדיה. בתגובה ל- CCL22, שני סוגי התאים, בין אם הם היו ממארחים זכרים או נקביים, הגיבו ל- CCL22. כמו כן, CCL22 גרם להגירה גדולה יותר מאשר CCL17 ב- ILC2 זכר.
מצד שני, CCL17 גרם הגירה משמעותית של תאי CD4 T הנשי ILC2 לעומת מדיה בלבד. טיפול CCL17 לא היה שונה מאשר מדיה עבור תאים זכר CD4 חיובי T או זכר ILC2. בתנאים תת-אופטימליים, כאשר הלוחית עם תאי CD4 נשארה בטמפרטורת החדר במשך 24 השעות הראשונות ולאחר מכן עברה לאנקובטור, לא הייתה הגירה לכיוון CCL22 ו- CCL17.
יתר על כן, הכדאיות של התאים היה נמוך במיוחד עבור התאים בתא התחתון, מראה את החשיבות של שימוש בטמפרטורות הנכונות ואת התנאים המתוארים בפרוטוקול זה כדי להשיג תוצאות אופטימליות. לאחר השלמת הליך ההתגלות, יש לראות הגירה משמעותית לכימוקין המעניין בהשוואה ל בארות השליטה בתקשורת. אם אין הגירה משמעותית לראות, ניתן להניח כי ההליך לא עבד כראוי או כי לימפוציטים אינם מגיבים כימוקין המדובר.
טכניקה זו יכולה לשמש באופן נרחב כדי להבין הגירת לימפוציטים כאשר לימפוציטים אלה עברו מגוון רחב של טיפולי vivo.
