פרויקט זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL087088 (ח&quot;כ) ו HL18208 (ח&quot;כ).

1. בידוד של האדם לימפוציטים-T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג דם אדם מתורם בריא. לאפשר לדם להתקרר לטמפרטורת החדר (~ 30 דקות) לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה 3 מ&quot;ל של בטמפרטורת החדר צפיפות התקשורת Polymorph הדרגתי לתוך צינור עגול 8 התחתונה מ&quot;ל קלקר. בעדינות להוסיף 3 מ&quot;ל של דם מלא על גבי מדיה Polymorph. חשוב כדי למנוע ערבוב של שני חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות בבית XG 500 במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, את כדוריות הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) נפרדו עכשיו לתוך שכבת התאים העליונה של מרכיבי דם אחרים. שכבת PBMC מופיע, מלמעלה למטה, כמו הלהקה מעונן הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את השלב ברור בצבע צהוב העליון של הדם, מעל שכבת PBMC, ולאחר מכן להשתמש micropipette P1000 להעביר את השכבה PBMC כדי 15 מ&quot;ל או 50 מ&quot;ל צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את PBMC פעמיים עם PBS, centrifuging תאים ב XG 500 במשך 5 דקות בכל פעם. Supernatant יהיה מעונן קצת אחרי כל שטיפה. </li></ol> 2. התרבות של האדם לימפוציטים-T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, העברת PBMC כדי בבקבוק T-75 תרבות 20 מ&quot;ל RPMI 1640 מדיה המכילה 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​phytohemagglutinin (PHA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 לפחות 1 שעה, עד 24 שעות. שלב זה מאפשר מונוציטים, אשר יהיה חסיד אל פני השטח את הבקבוק, להיות מופרדים מן לימפוציטים כי לרחף. אם הדגירה קצר (1 שעה) משמש בשלב זה, מקובל להשתמש RPMI 1640 מדיה המכילה 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין בלי להשלים עם PHA כפי שצוין בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להסיר את כל התקשורת מהבקבוק, להוסיף אותו צינור חרוטי 50 מ&quot;ל, ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה, אשר כעת כוללת בעיקר לימפוציטים, ולהעביר את התאים בבקבוק T-75 חדש המכיל 25 מ&quot;ל RPMI 1640 מדיה המכילה 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​PHA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים (2 ימים אם הדגירה הראשונית של PBMC היה לילה). לאחר 24 שעות של צמיחה, ייתכן שיהיה צורך להוסיף 15-20 מ&quot;ל של התקשורת טריים להעביר T-175 גדול יותר בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 ימים, להשתמש פיפטה להסיר את המדיה לימפוציטים מושעה מהבקבוק ומעבירים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ותאי להעביר בקבוק T-75 או T-175 חדש המכיל 25 מ&quot;ל (T-75) או 50 מ&quot;ל (T-175) RPMI 1640 עם 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 20 ng / mL האדם IL-2 או IL-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל לימפוציטים ימים 4-7. אם מתחילים עם בקבוק T-75, התרבות יהיה צורך להרחיב והועברו בקבוק T-175 לאחר 1-2 ימים. </li></ol> 3. Assay הגירה לימפוציטים חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 יום לפני assay ההגירה, מעיל זכוכית התחתונה 0.17 מ&quot;מ עם צלחת חלבון מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​או 20 G ב PBS לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המנה נרחב עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק ICAM-1/Fc האנושי (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) אדם SDF-1 (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) על ידי הוספת חומרים כימיים אלו בתמיסה PBS לצלחת ואת דוגרים 4 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לימפוציטים מסוג T על ידי הראשון בקביעת צפיפות התאים בתרבית בתוך בקבוק T-175 באמצעות hemacytometer. כ 2-5 x 10 5 תאים יש להשתמש לכל מנה להשיג צפיפות התאים המתאימים לניתוח הגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לימפוציטים מסוג T פעמיים עם PBS ו resuspend אז 1 מ&quot;ל L-15 מדיה המכילה 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​D-גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את צלחת מצופה ICAM-1/Fc ו - SDF-1 נרחב עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת לימפוציטים מסוג T ב 1 מ&quot;ל התקשורת על צלחת ולשמור אותם על 37 ° C. </li></ol> 4. לכידת תמונה ברצף באמצעות תוכנות ש&quot;ח Elements <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תוכנה ש&quot;ח אלמנטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט הגדרות המצלמה, בחר &quot;binning 2x2&quot; כמצב הדמיה שניהם חיים לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל התפריט Applications ובחר הגדר / הפעלה ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את משך הזמן בין התמונות את האורך הכולל של רצף לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &quot;הפעל&quot; כדי להתחיל רכישת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ניתן לעקוב ופרמטרים הגירה (מהירות, אורך הדרך, עקירה, וכו &#39;) לכמת באמצעות אחד כמה חבילות תוכנה, כולל ImageJ, AutoQuant או Volocity (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור &quot;מגרש קורי העכביש&quot;, xy את הקואורדינטות של כל תא timepoint נאספים (איור 2) ו מוקרנת על גרף עם נקודת מוצא משותפת עבור כל תא על המקור (איור 3). </li></ol> 5. נציג תוצאות ביום 6 של התרבות בנוכחות או IL-2 או IL-15, לימפוציטים מסוג T.לפצות&gt; 98% של תאים, כפי שנקבע על ידי מכתים CD3 חיובי כמו גם CD4 חיובי ו / או CD8 מכתים. עבור IL-2, מצאנו 83 תאים מסוג CD4 +%, 15% ו - CD8 + &lt;1% CD4 + CD8 + תאים. עבור IL-15, מצאנו 88 תאים מסוג CD4 +%, 11% ו - CD8 + &lt;1% CD4 + CD8 + תאים. במהלך הנדידה T לימפוציטים על ICAM-1/SDF-1 מצעים, תאים הציג מהירות של כ 15 מיקרומטר / min שיכולים להתקיים לאורך תקופת זמן 1 שעה. הגירה T לימפוציטים על ICAM-1/SDF-1 תלויה הידבקות LFA-1-בתיווך, כמו אנטי LFA-1 ליגנד חוסמות הנוגדן מעכב הגירה קשות. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מעקב סלולרי של העברת לימפוציטים מסוג T. לימפוציטים מסוג T מבודדים מהדם כולו בתרבית בנוכחות של IL-2 או IL-15 עבור 6 ימים הורשו לדבוק ולהעביר על קרקעית הזכוכית מאכלים מצופה 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ICAM-1 ו 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​SDF-1. תמונות נרכשו כל 10 שניות במשך 30 דקות. תאים זוהו כל תמונה מסומנים לאורך זמן באמצעות תוכנת Volocity. סרט זה מציג את ההגירה אקראי של לימפוציטים מסוג T במהירות של ~ 15 מיקרומטר / min. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a> 1. סרט Cell מעקב של העברת לימפוציטים מסוג T. לימפוציטים מסוג T מבודדים מהדם כולו בתרבית בנוכחות של IL-2 או IL-15 עבור 6 ימים הורשו לדבוק ולהעביר על תחתית צלחות זכוכית מצופה 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ICAM-1 ו 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​SDF-1 . תמונות נרכשו כל 10 שניות במשך 30 דקות. תאים זוהו כל תמונה מסומנים לאורך זמן באמצעות תוכנת Volocity. סרט זה מציג את ההגירה אקראי של לימפוציטים מסוג T במהירות של ~ 15 מיקרומטר / min. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. בעמדה תא Spatiotemporal. קואורדינטות XY של כל תא התקבלו עבור כל נקודת זמן באמצעות תוכנת Volocity. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. &quot;מזימה קורי עכביש&quot;. שימוש XYt קואורדינטות עבור כל תא, 15 תאים נבחרו באקראי זממו עם נקודת מוצא משותפת על המקור. השוואת באינטרנט חלקות עכביש נותן תיאור חזותי מהירה של ההבדלים הגירה בין תנאי הניסוי השונים. מגרשים הגירה T לימפוציטים בתנאים שליטה (פאנל משמאל) בנוכחות נוגדן ליגנד לחסימת אנטי LFA-1 (פאנל מימין).

<ol>
	<li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1.">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li><li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration.">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li><li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions.">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בניסוי זה, אנו מספקים פרטים על מערכת פשוטה לנתח את תנועתיות העיקרי של לימפוציטים מסוג T אנושיים. ב מבחני חוץ גופית הגירה שימשו לנתח את התפקידים של מולקולות רבות במעברי האותות המעורבים תנועה של תאים מסוגים שונים. חלק שולטת קריטי לזכור בעת תכנון הניסוי שלכם מת...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH300070.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Step Polymorphs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>AN221725</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Remel/Fisher Scientific</td>
<td>R30852801</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human IL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>202-IL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human IL-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>247-IL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>19459</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human ICAM-1/Fc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>720-IC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human SDF-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>350-NS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

human t lymphocyte isolation, culture and analysis of migration in vitro

ההגירה של לימפוציטים מסוג T מערבת את האינטראקציה של דבק integrins פני התא עם ligands הביע על תאים אחרים או עם חלבונים תאי מטריקס. הפעלת spatiotemporal המדויק של integrins ממצב נמוך זיקה למדינה זיקה גבוהה בקצה התא מוביל חשוב T לימפוציטים הגירה<sup&gt; 1</sup&gt;. כמו כן, הכחשה של קצה תא נגרר, או uropod, הוא צעד הכרחי בשמירה על תנועתיות מתמשך integrin תלויי T לימפוציטים<sup&gt; 2</sup&gt;. גישות טיפוליות רבות integrins מחלות אוטואימוניות דלקתיות או יעד כאמצעי לעכב את גיוס הגירה מופרזת של לויקוציטים<sup&gt; 3</sup&gt;. כדי לחקור את האירועים המולקולריים המווסתים את נדידת האדם T לימפוציטים, יש לנו מנוצל<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת לנתח נדידת תאים על מצע דו מימדי המחקה את הסביבה כי לימפוציטים T מפגשים במהלך גיוס של כלי הדם. לימפוציטים מסוג T הם בודד לראשונה מתורמים האדם הם מגורה אז בתרבית במשך שבעה עד עשרה ימים. במהלך assay, לימפוציטים מסוג T מותר לדבוק ולהעביר על מצע מצופה מולקולה-1 הידבקות אינטר (ICAM-1), ליגנד עבור integrin LFA-1, הגורם-1 סטרומה תא הנגזרות (SDF-1). הנתונים שלנו מראים כי לימפוציטים מסוג T התערוכה מהירות הנדידה של ~ 15 מיקרומטר / min. T לימפוציטים הגירה יכולה להיות מעוכבים על ידי המצור integrin<sup&gt; 1</sup&gt; או מעכבי של המנגנון המווסת actomyosin הסלולר נדידת תאים<sup&gt; 2</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro at JoVE.com

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T לימפוציטים<em&gt; במבחנה</em&gt;.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

46.1K Views.  University of Rochester. T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T לימפוציטים במבחנה.

Video: Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...