Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

הצהרת מוסר: כל הנהלים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי ועדת האתיקה הקלינית באוניברסיטת טובינגן (פרויקטי 38 / 2009B02 ו470 / 2013B02). 1. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50-100 מ&quot;ל ממתנדב בריא באמצעות venipuncture באמצעות מזרק 50 מיליליטר מכיל 1,000 סולפט הפרין IU ולדלל את הדם 1: 2 עם PBS (pH = 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה בזהירות 35 מיליליטר של הדם: פתרון PBS על פתרון הפרדת 15 מיליליטר דם כגון Biocoll (ד = 1.077 גרם / מיליליטר) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 800 XG ב RT. הערה: אין להשתמש בבלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים של שכבת ימפוציטית עם טפטפת ולשטוף את התאים פעמיים בלפחות 50 מיליליטר PBS (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב 400 XG). הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse נותר אריתרוציטים ידי השעיית וincubating חלק ימפוציטית עם 1-5 מיליליטר של תמיסת חיץ hypotonic במשך 2-4 דקות. הערה: משך החשיפה והנפח של lysing חיץ תלוי בחיץ lysing משמש ועל כמות תאי דם אדומים שנשארו בחלק הלימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים עם PBS (01:10) וצנטריפוגות ב 250 XG דקות 12 ולאחר מכן resuspend ולשטוף את התא גלולה פעם אחת ב 10 מיליליטר PBS ב XG 300 דקות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend לימפוציטים בPBS ולספור את התאים בתא ספירת נויבאואר באמצעות Trypan פתרון כחול. הערה: בדרך כלל,&gt; 1 x 10 8 ימפוציטים מתקבלים מ-100 מיליליטר טרי נמשכת דם היקפי. </li></ol> 2. בידוד של תאי T Vδ1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח &lt;1 x 10 6 ימפוציטים מבודדים לFACS ראשוני קביעת התדירות של תאי CD4 T Vδ1. הערה: גודל אוכלוסייה של ישות T-cell זה עשוי להיות שונה מאוד בין אנשים ובהתאם למצב החיסוני שלהם. Typicברית, כ -1% מתאי T הם Vδ1 + ועל 1-5% מVδ1 + התאים CD4 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים עם 1 מיליליטר FACS חיץ, אשר מורכב מPBS FCS המכיל 2% ו 5 מ&quot;מ EDTA. צנטריפוגה ב 660 XG למשך 2 דקות ולמזוג supernatant. ריפלוקס הנפח של חיץ FACS על 100 μl מספיק לצביעה לאחר מכן. בקצרה מערבולת דגירה התאים עם 5 μl FC-חסימה מגיב במשך 5 דקות על RT עבור סגוליות מוגבר של הכתמת FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נוגדנים חד שבטיים אנושיים ישירות לתאים מבלי להסיר את חסימה מגיב-FC. הקפד להכתים את התאים עם נוגדנים נגד Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) וTCRαβ (01:25). הכן את שליטת אלוטיפ עם isotypes אימונוגלובולינים המקביל. דגירה תאים עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים במאגר FACS מיליליטר 1 (צנטריפוגות במשך 2 דקות, ב660 XG), למזוג supernatant ולהמשיך לרכישת FACS בנותר חיץ הנפח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize התאים (שאינם משמשים בניתוח FACS) על ידי צנטריפוגה דקות 12; ב300 גרם; 8 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend תא pelletin 60 μl MACS-חיץ לכל 1 x 10 7 תאים. הוסף 20 מגיב חסימה-FC μl לכל 1 x 10 7 תאי דגירה במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl נוגדן Vδ1 אנטי אנושי FITC- מצומדות לכל 1 x 10 7 תאים ישירות לתאים. דגירה של 12 דקות על 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים באמצעות 14 מיליליטר MACS-חיץ (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב 300 גרם; 8 מעלות צלזיוס). בטל supernatant לחלוטין וresuspend תאי חיץ MACS 80 μl ל1x10 7 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1-2 x 10 5 תאים ולדלל אותם במאגר FACS 100 μl לאימות של התיוג על ידי ניתוח FACS. אין תוספים נוספים נדרשים לצעד זה. ודא שיש suffiהבדל מספיק בבהירות לVδ1 - ותאי Vδ1 +. אם זה לא המקרה, חזור על שלבים 2.3) ו -2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף microbeads אנטי FITC 20 μl לכל 1 x 10 7 תאים לתאים הנותרים, ומערבב היטב דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את התאים באמצעות לפחות 10 חיץ MACS מיליליטר (צנטריפוגות במשך 12 דקות, ב XG 300; 8 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, לאזן את העמודה המגנטית מקורר מראש להציב מגנט עם חיץ MACS 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 500 μl MACS-חיץ (למספרים סלולריים גבוהה יותר מאשר 1 x 10 8, בהיקף של עד נפח זה בהתאם) ולהחיל את התאים בזהירות על הטור. לאסוף את הזרימה דרך מכיל Vδ1 - תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 μl MACS-חיץ ולאסוף את הזרימה דרך שוב באותו הצינור. שים לב שהמאגר חייב להיות ריק לפני יישום חיץ על הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהמכשיר המגנטי ולמקם אותו לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. מהירות לשטוף את העמודה עם חיץ MACS 1 מיליליטר בתוקף דוחף את הבוכנה לתוך הטור. לאסוף את eluate בצינור. הערה: על מנת לקבל טוהר&gt; 98%, זה בדרך כלל צורך לחזור על שלבים 2.7-2.9) עם עמודה שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את הטוהר של התאים על ידי ניתוח FACS 18 עם אותו פנל הנוגדנים כמו קודם (ראה 2.1.2) ולספור את התאים. </li></ol> 3. בידוד של תאי Vδ1CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 25 μl של חרוזים CD4 עם מערבולת ל&gt; 30 שניות. שטוף את החרוזים (הסכום המינימאלי כמתואר על ידי היצרן) בחיץ 1 מיליליטר MACS בצינור 1.5 מיליליטר תגובה על ידי הנחת הצינור לאבן שואבת ל1 דקות. בטל supernatant בזהירות עם פיפטה בקנה מידה קטנה (200 μl) וresuspend חרוזים בנפח המקורי של MACS-חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize Vδ1 + תאים (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב XG 300) ולשאוב supernatant ו resuspend כל Vδ1 התאים + ב500 μl MACS-חיץ ולהוסיף אותם לצינור המכיל את החרוזים. מערבבים נמרצות ודגירה של 20 דקות ב 4 ° C עם הטיה קבועה (למשל, במסובב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את התאים במגנט למשך 2 דקות. ודא שאין שאריות במכסה. הערה: תאי CD4 + תהיה מחויבים חרוזים המגנטיים ולצרף לצד של הצינור מול המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את המכסה תוך שמירה על הצינור בתוך המכשיר המגנטי ולאסוף את supernatant המכיל CD4 - Vδ1 + תאים בעזרת פיפטה בקנה מידה קטנה. הנח CD4 - Vδ1 + תאים לתוך צינור נפרד ומניח הצינור הזה לתוך המגנט שוב כדי למנוע אולי נותרו תאי CD4 או חרוזים מהאוכלוסייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את CD4 - תאים ב 5 מיליליטר MACS-חיץ (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב XG 300)ND resuspend אותם בריכוז של 1 x 10 5 תאים לכל 100 מדיה μl. CD4 - תאים יכולים להיות מתורבתים בקלות בתנאים כדלקמן (4.2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור עם מטרות תאי CD4 + מחוץ לשדה המגנטי, resuspend תאי 500 μl MACS-חיץ ולשים אותם בחזרה לתוך המכשיר המגנטי. חזור על שלבים 3.3-3.5 פעמיים כדי להשיג טוהר גבוה יותר. הסר supernatant ידי pipetting </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend CD4 + התאים בתקשורת ותרבות 100 μl (1640 RPMI, FCS 10%, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין) ולהוסיף 10 μl של פתרון ניתוק-חרוז. לדגור על RT עבור 45 דקות עם הטיה קבועה (למשל, במסובב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים במגנט דקות 1. לאסוף בזהירות את supernatant המכיל תאים + CD4 + ללא חרוז Vδ1 בעזרת פיפטה בקנה מידה קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחוץ למגנט, resuspend חרוזים עם תקשורת ותרבות 100 μl וחזורצעדים 3.6 ו -3.7 פעמיים כדי לקבל מספרים סלולריים גבוהים יותר של תאים מסוג CD4 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize התאים (צנטריפוגות ב 300 XG, דקות 12) וזורקים supernatant לחלוטין על ידי pipetting. Resuspend תאים בתקשורת טרי, מחוממת מראש ולספור אותם. לבחון את טוהר של Vδ1 + CD4 + התאים על ידי ניתוח FACS המתואר בצעדי 2.1.1-2.1.3. </li></ol> 4. תא בודד שיבוט על ידי דילול מוגבל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) מתורם אלוגנאית כמתוארים ב1.1-1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין 2.5 x 10 7 PBMCs אלוגנאית עם 80 Gy בתקשורת ותרבות 25 מיליליטר באמצעות γ-קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) וPHA (2 מיקרוגרם / מיליליטר) לתאים מזינים המוקרנים ולהפיץ אותם ב96-גם צלחות U-צורה, 5 x 10 4 מזין תאים ב -50 μl בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תאי Vδ1 + CD4 + לריכוז של 0.3 תאים לכל 50 μl. Pipette 50 μl של פתרון התא לכל מחסה גם תאים וציטוקינים המוקרנים. הערה: כך, ציטוקינים הם בדילול לריכוז הסופי של 100 IL-2, 10 ng / ml PHA מיליליטר U / IL-7 ו 1 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה צלחות 96-היטב בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אווירת humidified. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לטפח נותר מטוהר Vδ1 + CD4 + תאים כתרבות בתפזורת באותם תנאי התרבות כמו השיבוטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את התאים כל 3-4 ימים עם ציטוקינים ותקשורת טריות. לשם כך, מחצית חילופי הבינוני בבארות עם 50 בינוני μl טרי על ידי pipetting. להוסיף ריכוז פי 2 של ציטוקינים לכל תוספת. להוסיף 5x10 4 תאים מזינים המוקרנים לכל גם כל סיבוב של האכלה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, להתבונן השיבוטים הראשונים הפכו גלויים לאחר 3-4 שבועות, כפי שהם חילוף חומרים ובכך לשנות את הצבע של המושבות בינוני תרבות וצורה. הערה: לפרווהטיפוח יס, resuspend השיבוטים היטב ולהעביר אותם להפריד 96-גם צלחות. נתח את התאים באמצעות FACS כפי שצוין ב2.1.1-2.1.3. שיבוטים המשיכו בתנאים אלה עלולים סופו של דבר לשנות את TCR שלהם מVδ1 לαβTCR. הנקודה לtransdifferentiation זה הזמן משתנה משיבוט לשבט. </li></ol>

<ol>
	<li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li><li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Ferrero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCRgamma+silencing+during+alphabeta+T+cell+development+depends+upon+pre-TCR-induced+proliferation.">TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.</a> J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).</li><li>Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforcing+order+within+a+complex+locus:+current+perspectives+on+the+control+of+V(D)J+recombination+at+the+murine+T-cell+receptor+alpha/delta+locus.">Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus.</a> Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+rearranged+variable+gene+segments+in+directing+secondary+T+cell+receptor+alpha+recombination.">Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TCR+delta+and+alpha+repertoires+by+local+and+long-distance+control+of+variable+gene+segment+chromatin+structure.">Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure.</a> J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).</li><li>Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+receptor+alpha+gene+assembly+by+a+complex+hierarchy+of+germline+Jalpha+promoters.">Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters.</a> Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).</li><li>Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+constraints+at+the+level+of+TCRalpha+rearrangement+impact+Valpha14i+NKT+cell+development.">Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development.</a> J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).</li><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).</li><li>Sprent, J., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+life-span+and+memory.">Lymphocyte life-span and memory.</a> Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).</li><li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+T+cell+lymphopoiesis:+ontogeny+and+contribution+to+gut+intraepithelial+lymphocytes+in+athymic+and+euthymic+mice.">Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice.</a> J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).</li><li>McClory, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stepwise+program+of+extrathymic+T+cell+development+within+the+human+tonsil.">Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil.</a> J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).</li><li>Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+maturation+of+alpha+beta+T+cells+from+hemopoietic+stem+cells.">Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).</li><li>Garcia-Ojeda, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+development+of+committed+progenitors+in+the+bone+marrow+that+generate+functional+T+cells+in+the+absence+of+the+thymus.">Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus.</a> J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).</li><li>Arcangeli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+hemopoietic+progenitors+committed+to+T+cell+differentiation+in+the+adult+mouse.">Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse.</a> J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ללמוד את הפנוטיפ, הביולוגיה ותפקוד של גוף תא נדיר (טי), כלומר תאי Vδ1 + CD4 + T, השתמשנו שני סמנים: Vδ1 וCD4 לבידוד המגנטי החיובי שלה תא. Vδ1 הוא קולטן יתום, ואילו CD4 מתבטא בתאי T מסייע, ברמה נמוכה יותר במונוציטים ותאים דנדריטיים, וברמה נמוכה מאוד ובתאי hematopoietic. <p class="...

בבעלי חוליות, חסינות אדפטיבית שבנויה בסלולרי וחלק הלחות של חסינות משחקת תפקיד מרכזי בהגנה מפני פתוגנים. ההכרה במגוון רחב של אנטיגנים מתווך על ידי T-hyperpolymorphic וקולטני תא B (TCR / BCR), אשר ביחס לתאי T הם הניחו להיות מיוצרים בעיקר בבלוטת התימוס 1. לכך, תאי גזע hematopoietic (HSCs), הנגזרים ממח עצם, זרע התימוס ולהבדיל לאורך שלבים מוגדרים היטב לבסוף והוליד את כל שושלות תאי T. אבות זריעת התימוס הם CD4 - וCD8 - ובכך מהווים את חלק thymocyte לא בוגר, שלילי כפול (DN). אותות נגזר התימוס אז לגרום למחויבות שושלת היוחסין שלהם ובידול לאו תאי T αβ או γδ. הביטוי של גני שרשרת תפקודית משוחלפים TCR-γ וTCR-δ בDN2 / 3 thymocytes מוביל לγ מתחמי δTCR, אשר כונן תרבות תאיםd לקדם בידול לתאי δT γ 2,3. לעומת זאת, הארגון מחדש של שרשרת TCR-β פונקציונלי, שיכול להתאים עם preTα לבנות PT preTCR, גורם להשתקת תעתיק של שרשרת TCR-γ בthymocytes DN3 ומעברם לthymocytes CD4 + CD8 + כפול החיובי 4 . בשלב זה, רקומבינציה של שרשרת TCR-α מתרחשת, מחיקת מוקד TCR-δ שמקנן בתוך מוקד TCR-α, וכך בביטול הייצור γδTCR בתאים אלה באופן בלתי הפיך 5-9. αβTCRs מחדש נבחר לאחר מכן ליכולתם להיקשר עצמי MHC חלש (בחירה חיובית), אשר לא תעלה על סף מסוים, כדי למנוע אוטואימוניות (סלקציה שלילית). על פי יכולתם של מחייב כיתת MHC I או II, תאי αβT נבחרו להתפתח לאחד חיובי מסוג CD4 + או CD8 + T תאים, שיציאת התימוס תאי T נאיביים כ. עם זאת, לפוף של התימוס מתחיל מוקדם בחיים המובילים לתפוקה מופחתת באופן אקספוננציאלי של תאי T הנאיביים שהיא פוסט-התבגרות כמעט כבויה 10. עם זאת, בגודל של בריכת תא T נשאר קבוע לאורך כל חיים, שיכול להיות מוסבר רק בחלקו על ידי התפשטות פוסט-הרתי homeostatic של תאי T וההתפשטות של זיכרון חיסוני הארוך חי 11. כתוצאה מכך, חייבת להתרחש התפתחות תאי T extrathymic. מחקר שנערך לאחרונה צבר משיכה משמעותית שאפיינה את אבות תא αβT, אשר-בextrathymic אתרים-הולידו αβ התפקודי תאי T 12-17. עם זאת, ידע מפורט על מבשרי תא αβT extrathymic שעצמאיים מהתימוס להתמיין לתאי αβT הוא מקוטע כמו הרקע שיש לנו במסלול שהם לוקחים ובכך. לאחרונה זיהו את ישות תא T הקטנה של Vδ1 + </sup&gt; תאי CD4 + γδT כprognitor extrathymic αβT תא 18, שכאשר מבודדים מהדם היקפי של תורמים אנושיים בריאים יכול transdifferentiate לתאי αβT בסביבה דלקתית קלה. מעניין ובניגוד לתרבות הומיאוסטטית של תאי T פוסט-הרתי, transdifferentiation של Vδ1 CD4 + תאים מייצר קולטנים תא T חדשים, ובכך להרחיב את מגוון הרפרטואר, כך שיכולים להיות מוכרים אנטיגנים חדשים פוטנציאלי והוא רשאי הגנת המארח מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. זה מוסיף לגמישות של תאי T ומוסיף עד כה שלא מעריך את מסלול חדש לפיתוח תא T extrathymic. בידוד כמותית ממקורות ימפוציטית, הדור של שיבוטים תא בודד וההרחבה היעילה שלהם הם חיוניים למטרה לזהות את אותם סמנים ומולקולות המפעילים תא αβT זה precursor`s פיתוח extrathymic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biocoll Solution</td>
			<td style="width:93px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L 6113</td>
			<td style="width:361px;">lymphocyte separating solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysing Buffer</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>lysis of erythrocytes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MACS buffer</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>supplement with BSA and pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human Vd1 FITC (clone:&#160; TS8.2)</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td>TCR2730</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>345766</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555548</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-333</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>641400</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Anti-FITC MultiSort Kit</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-058-701</td>
			<td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS columns</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td>pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CD4 Positive Isolation Kit</td>
			<td style="width:93px;">life technologies</td>
			<td>11331D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

התימוס, האיבר העיקרי לייצור תאי T αβ ועמוד השדרה של המערכת החיסונית אדפטיבית בבעלי חוליות, כבר מזמן נחשב כמקור היחיד של תאי αβT. ובכל זאת, לפוף הרתי מתחיל מוקדם בחיים מובילים לתפוקה מופחתת באופן דרסטי של תאי αβT נאיביים לפריפריה. עם זאת, גם בני מאה יכולה לבנות חסינות מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. המחקרים אחרונים מצביעים פיתוח תא αβT extrathymic, אולם ההבנה שלנו של מסלולים שעשויות לפצות על אובדן הרתי של פונקציה עדיין rudimental. תאי T γδ הם לימפוציטים מולדים המהווים תת-הקבוצה T-cell העיקרי ברקמות. לאחרונה ייחסו פונקציה מצטיינת עד כה שלא מעריכים לקבוצת משנה תא T γδ ידי מראה כי הישות נדירה של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T יכולים transdifferentiate לתאי αβT במצבים דלקתיים. כאן, אנו עמ &#39;rovide הפרוטוקול לבידוד של אב זה מהדם היקפי והטיפוח הבא שלה. תאי Vδ1 מועשרים באופן חיובי מPBMCs של תורמים אנושיים בריאים באמצעות חרוזים מגנטיים, ואחריו שלב שני שבו אנו ממקדים את החלק יחסי הנדירים של תאי CD4 + עם טכניקת תיוג מגנטית נוספת. הכוח המגנטי של התיוג השני עולה על אחד מהתווית המגנטית הראשונה, ובכך מאפשר את הבידוד החיובי יעיל, כמותי וספציפי של האוכלוסייה של עניין. לאחר מכן, אנו מציגים את מצב הטכניקה והתרבות הנדרש לשיבוט וביעילות הרחבת התאים ולזיהוי של השיבוטים שנוצרו על ידי ניתוח FACS. לפיכך, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לטיהור, התרבות והרחבת vivo לשעבר של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T. ידע זה הוא תנאי הכרחי ללימודים הקשורים לביולוגיה progenitor`s תא αβT זה ועבור מי ששואף לאיידntify גורמים המולקולריים המעורבים בtransdifferentiation.

איור 1 מתאר את השלבים השונים ואת התוצאה של הבידוד של תאי T Vδ1 מהדם היקפי. איור 1 א מציג התפלגות טיפוסית של Vδ1 + תאים לימפוציטים בCD3 +, כמו גם ביטוי שיתוף קולט של אוכלוסיית Vδ1 +. בתורם זה, תדירות Vδ1 + תאים (אדום) היא 2.3% מכלל ספירת הלימפ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÎ´1+CD4+Î³Î´ T Cells, an Extrathymic Î±Î²T-cell Progenitor at JoVE.com

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K Views.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Video: Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

אקס הרחבה vivo של גידול תאים T-reactive באמצעות 1/Ionomycin Bryostatin ואת גמא נפוצים שרשרת גיבוש ציטוקינים

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...