Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

הצהרת מוסר: כל הנהלים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי ועדת האתיקה הקלינית באוניברסיטת טובינגן (פרויקטי 38 / 2009B02 ו470 / 2013B02). 1. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50-100 מ&quot;ל ממתנדב בריא באמצעות venipuncture באמצעות מזרק 50 מיליליטר מכיל 1,000 סולפט הפרין IU ולדלל את הדם 1: 2 עם PBS (pH = 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה בזהירות 35 מיליליטר של הדם: פתרון PBS על פתרון הפרדת 15 מיליליטר דם כגון Biocoll (ד = 1.077 גרם / מיליליטר) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 800 XG ב RT. הערה: אין להשתמש בבלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים של שכבת ימפוציטית עם טפטפת ולשטוף את התאים פעמיים בלפחות 50 מיליליטר PBS (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב 400 XG). הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse נותר אריתרוציטים ידי השעיית וincubating חלק ימפוציטית עם 1-5 מיליליטר של תמיסת חיץ hypotonic במשך 2-4 דקות. הערה: משך החשיפה והנפח של lysing חיץ תלוי בחיץ lysing משמש ועל כמות תאי דם אדומים שנשארו בחלק הלימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים עם PBS (01:10) וצנטריפוגות ב 250 XG דקות 12 ולאחר מכן resuspend ולשטוף את התא גלולה פעם אחת ב 10 מיליליטר PBS ב XG 300 דקות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend לימפוציטים בPBS ולספור את התאים בתא ספירת נויבאואר באמצעות Trypan פתרון כחול. הערה: בדרך כלל,&gt; 1 x 10 8 ימפוציטים מתקבלים מ-100 מיליליטר טרי נמשכת דם היקפי. </li></ol> 2. בידוד של תאי T Vδ1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח &lt;1 x 10 6 ימפוציטים מבודדים לFACS ראשוני קביעת התדירות של תאי CD4 T Vδ1. הערה: גודל אוכלוסייה של ישות T-cell זה עשוי להיות שונה מאוד בין אנשים ובהתאם למצב החיסוני שלהם. Typicברית, כ -1% מתאי T הם Vδ1 + ועל 1-5% מVδ1 + התאים CD4 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים עם 1 מיליליטר FACS חיץ, אשר מורכב מPBS FCS המכיל 2% ו 5 מ&quot;מ EDTA. צנטריפוגה ב 660 XG למשך 2 דקות ולמזוג supernatant. ריפלוקס הנפח של חיץ FACS על 100 μl מספיק לצביעה לאחר מכן. בקצרה מערבולת דגירה התאים עם 5 μl FC-חסימה מגיב במשך 5 דקות על RT עבור סגוליות מוגבר של הכתמת FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נוגדנים חד שבטיים אנושיים ישירות לתאים מבלי להסיר את חסימה מגיב-FC. הקפד להכתים את התאים עם נוגדנים נגד Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) וTCRαβ (01:25). הכן את שליטת אלוטיפ עם isotypes אימונוגלובולינים המקביל. דגירה תאים עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים במאגר FACS מיליליטר 1 (צנטריפוגות במשך 2 דקות, ב660 XG), למזוג supernatant ולהמשיך לרכישת FACS בנותר חיץ הנפח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize התאים (שאינם משמשים בניתוח FACS) על ידי צנטריפוגה דקות 12; ב300 גרם; 8 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend תא pelletin 60 μl MACS-חיץ לכל 1 x 10 7 תאים. הוסף 20 מגיב חסימה-FC μl לכל 1 x 10 7 תאי דגירה במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl נוגדן Vδ1 אנטי אנושי FITC- מצומדות לכל 1 x 10 7 תאים ישירות לתאים. דגירה של 12 דקות על 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים באמצעות 14 מיליליטר MACS-חיץ (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב 300 גרם; 8 מעלות צלזיוס). בטל supernatant לחלוטין וresuspend תאי חיץ MACS 80 μl ל1x10 7 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1-2 x 10 5 תאים ולדלל אותם במאגר FACS 100 μl לאימות של התיוג על ידי ניתוח FACS. אין תוספים נוספים נדרשים לצעד זה. ודא שיש suffiהבדל מספיק בבהירות לVδ1 - ותאי Vδ1 +. אם זה לא המקרה, חזור על שלבים 2.3) ו -2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף microbeads אנטי FITC 20 μl לכל 1 x 10 7 תאים לתאים הנותרים, ומערבב היטב דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את התאים באמצעות לפחות 10 חיץ MACS מיליליטר (צנטריפוגות במשך 12 דקות, ב XG 300; 8 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, לאזן את העמודה המגנטית מקורר מראש להציב מגנט עם חיץ MACS 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 500 μl MACS-חיץ (למספרים סלולריים גבוהה יותר מאשר 1 x 10 8, בהיקף של עד נפח זה בהתאם) ולהחיל את התאים בזהירות על הטור. לאסוף את הזרימה דרך מכיל Vδ1 - תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 μl MACS-חיץ ולאסוף את הזרימה דרך שוב באותו הצינור. שים לב שהמאגר חייב להיות ריק לפני יישום חיץ על הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהמכשיר המגנטי ולמקם אותו לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. מהירות לשטוף את העמודה עם חיץ MACS 1 מיליליטר בתוקף דוחף את הבוכנה לתוך הטור. לאסוף את eluate בצינור. הערה: על מנת לקבל טוהר&gt; 98%, זה בדרך כלל צורך לחזור על שלבים 2.7-2.9) עם עמודה שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את הטוהר של התאים על ידי ניתוח FACS 18 עם אותו פנל הנוגדנים כמו קודם (ראה 2.1.2) ולספור את התאים. </li></ol> 3. בידוד של תאי Vδ1CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 25 μl של חרוזים CD4 עם מערבולת ל&gt; 30 שניות. שטוף את החרוזים (הסכום המינימאלי כמתואר על ידי היצרן) בחיץ 1 מיליליטר MACS בצינור 1.5 מיליליטר תגובה על ידי הנחת הצינור לאבן שואבת ל1 דקות. בטל supernatant בזהירות עם פיפטה בקנה מידה קטנה (200 μl) וresuspend חרוזים בנפח המקורי של MACS-חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize Vδ1 + תאים (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב XG 300) ולשאוב supernatant ו resuspend כל Vδ1 התאים + ב500 μl MACS-חיץ ולהוסיף אותם לצינור המכיל את החרוזים. מערבבים נמרצות ודגירה של 20 דקות ב 4 ° C עם הטיה קבועה (למשל, במסובב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את התאים במגנט למשך 2 דקות. ודא שאין שאריות במכסה. הערה: תאי CD4 + תהיה מחויבים חרוזים המגנטיים ולצרף לצד של הצינור מול המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את המכסה תוך שמירה על הצינור בתוך המכשיר המגנטי ולאסוף את supernatant המכיל CD4 - Vδ1 + תאים בעזרת פיפטה בקנה מידה קטנה. הנח CD4 - Vδ1 + תאים לתוך צינור נפרד ומניח הצינור הזה לתוך המגנט שוב כדי למנוע אולי נותרו תאי CD4 או חרוזים מהאוכלוסייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את CD4 - תאים ב 5 מיליליטר MACS-חיץ (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב XG 300)ND resuspend אותם בריכוז של 1 x 10 5 תאים לכל 100 מדיה μl. CD4 - תאים יכולים להיות מתורבתים בקלות בתנאים כדלקמן (4.2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור עם מטרות תאי CD4 + מחוץ לשדה המגנטי, resuspend תאי 500 μl MACS-חיץ ולשים אותם בחזרה לתוך המכשיר המגנטי. חזור על שלבים 3.3-3.5 פעמיים כדי להשיג טוהר גבוה יותר. הסר supernatant ידי pipetting </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend CD4 + התאים בתקשורת ותרבות 100 μl (1640 RPMI, FCS 10%, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין) ולהוסיף 10 μl של פתרון ניתוק-חרוז. לדגור על RT עבור 45 דקות עם הטיה קבועה (למשל, במסובב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים במגנט דקות 1. לאסוף בזהירות את supernatant המכיל תאים + CD4 + ללא חרוז Vδ1 בעזרת פיפטה בקנה מידה קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחוץ למגנט, resuspend חרוזים עם תקשורת ותרבות 100 μl וחזורצעדים 3.6 ו -3.7 פעמיים כדי לקבל מספרים סלולריים גבוהים יותר של תאים מסוג CD4 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pelletize התאים (צנטריפוגות ב 300 XG, דקות 12) וזורקים supernatant לחלוטין על ידי pipetting. Resuspend תאים בתקשורת טרי, מחוממת מראש ולספור אותם. לבחון את טוהר של Vδ1 + CD4 + התאים על ידי ניתוח FACS המתואר בצעדי 2.1.1-2.1.3. </li></ol> 4. תא בודד שיבוט על ידי דילול מוגבל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) מתורם אלוגנאית כמתוארים ב1.1-1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין 2.5 x 10 7 PBMCs אלוגנאית עם 80 Gy בתקשורת ותרבות 25 מיליליטר באמצעות γ-קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) וPHA (2 מיקרוגרם / מיליליטר) לתאים מזינים המוקרנים ולהפיץ אותם ב96-גם צלחות U-צורה, 5 x 10 4 מזין תאים ב -50 μl בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תאי Vδ1 + CD4 + לריכוז של 0.3 תאים לכל 50 μl. Pipette 50 μl של פתרון התא לכל מחסה גם תאים וציטוקינים המוקרנים. הערה: כך, ציטוקינים הם בדילול לריכוז הסופי של 100 IL-2, 10 ng / ml PHA מיליליטר U / IL-7 ו 1 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה צלחות 96-היטב בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אווירת humidified. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לטפח נותר מטוהר Vδ1 + CD4 + תאים כתרבות בתפזורת באותם תנאי התרבות כמו השיבוטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את התאים כל 3-4 ימים עם ציטוקינים ותקשורת טריות. לשם כך, מחצית חילופי הבינוני בבארות עם 50 בינוני μl טרי על ידי pipetting. להוסיף ריכוז פי 2 של ציטוקינים לכל תוספת. להוסיף 5x10 4 תאים מזינים המוקרנים לכל גם כל סיבוב של האכלה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, להתבונן השיבוטים הראשונים הפכו גלויים לאחר 3-4 שבועות, כפי שהם חילוף חומרים ובכך לשנות את הצבע של המושבות בינוני תרבות וצורה. הערה: לפרווהטיפוח יס, resuspend השיבוטים היטב ולהעביר אותם להפריד 96-גם צלחות. נתח את התאים באמצעות FACS כפי שצוין ב2.1.1-2.1.3. שיבוטים המשיכו בתנאים אלה עלולים סופו של דבר לשנות את TCR שלהם מVδ1 לαβTCR. הנקודה לtransdifferentiation זה הזמן משתנה משיבוט לשבט. </li></ol>

<ol>
	<li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li><li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Ferrero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCRgamma+silencing+during+alphabeta+T+cell+development+depends+upon+pre-TCR-induced+proliferation.">TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.</a> J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).</li><li>Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforcing+order+within+a+complex+locus:+current+perspectives+on+the+control+of+V(D)J+recombination+at+the+murine+T-cell+receptor+alpha/delta+locus.">Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus.</a> Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+rearranged+variable+gene+segments+in+directing+secondary+T+cell+receptor+alpha+recombination.">Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TCR+delta+and+alpha+repertoires+by+local+and+long-distance+control+of+variable+gene+segment+chromatin+structure.">Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure.</a> J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).</li><li>Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+receptor+alpha+gene+assembly+by+a+complex+hierarchy+of+germline+Jalpha+promoters.">Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters.</a> Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).</li><li>Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+constraints+at+the+level+of+TCRalpha+rearrangement+impact+Valpha14i+NKT+cell+development.">Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development.</a> J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).</li><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).</li><li>Sprent, J., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+life-span+and+memory.">Lymphocyte life-span and memory.</a> Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).</li><li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+T+cell+lymphopoiesis:+ontogeny+and+contribution+to+gut+intraepithelial+lymphocytes+in+athymic+and+euthymic+mice.">Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice.</a> J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).</li><li>McClory, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stepwise+program+of+extrathymic+T+cell+development+within+the+human+tonsil.">Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil.</a> J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).</li><li>Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+maturation+of+alpha+beta+T+cells+from+hemopoietic+stem+cells.">Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).</li><li>Garcia-Ojeda, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+development+of+committed+progenitors+in+the+bone+marrow+that+generate+functional+T+cells+in+the+absence+of+the+thymus.">Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus.</a> J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).</li><li>Arcangeli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+hemopoietic+progenitors+committed+to+T+cell+differentiation+in+the+adult+mouse.">Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse.</a> J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ללמוד את הפנוטיפ, הביולוגיה ותפקוד של גוף תא נדיר (טי), כלומר תאי Vδ1 + CD4 + T, השתמשנו שני סמנים: Vδ1 וCD4 לבידוד המגנטי החיובי שלה תא. Vδ1 הוא קולטן יתום, ואילו CD4 מתבטא בתאי T מסייע, ברמה נמוכה יותר במונוציטים ותאים דנדריטיים, וברמה נמוכה מאוד ובתאי hematopoietic. <p class="...

בבעלי חוליות, חסינות אדפטיבית שבנויה בסלולרי וחלק הלחות של חסינות משחקת תפקיד מרכזי בהגנה מפני פתוגנים. ההכרה במגוון רחב של אנטיגנים מתווך על ידי T-hyperpolymorphic וקולטני תא B (TCR / BCR), אשר ביחס לתאי T הם הניחו להיות מיוצרים בעיקר בבלוטת התימוס 1. לכך, תאי גזע hematopoietic (HSCs), הנגזרים ממח עצם, זרע התימוס ולהבדיל לאורך שלבים מוגדרים היטב לבסוף והוליד את כל שושלות תאי T. אבות זריעת התימוס הם CD4 - וCD8 - ובכך מהווים את חלק thymocyte לא בוגר, שלילי כפול (DN). אותות נגזר התימוס אז לגרום למחויבות שושלת היוחסין שלהם ובידול לאו תאי T αβ או γδ. הביטוי של גני שרשרת תפקודית משוחלפים TCR-γ וTCR-δ בDN2 / 3 thymocytes מוביל לγ מתחמי δTCR, אשר כונן תרבות תאיםd לקדם בידול לתאי δT γ 2,3. לעומת זאת, הארגון מחדש של שרשרת TCR-β פונקציונלי, שיכול להתאים עם preTα לבנות PT preTCR, גורם להשתקת תעתיק של שרשרת TCR-γ בthymocytes DN3 ומעברם לthymocytes CD4 + CD8 + כפול החיובי 4 . בשלב זה, רקומבינציה של שרשרת TCR-α מתרחשת, מחיקת מוקד TCR-δ שמקנן בתוך מוקד TCR-α, וכך בביטול הייצור γδTCR בתאים אלה באופן בלתי הפיך 5-9. αβTCRs מחדש נבחר לאחר מכן ליכולתם להיקשר עצמי MHC חלש (בחירה חיובית), אשר לא תעלה על סף מסוים, כדי למנוע אוטואימוניות (סלקציה שלילית). על פי יכולתם של מחייב כיתת MHC I או II, תאי αβT נבחרו להתפתח לאחד חיובי מסוג CD4 + או CD8 + T תאים, שיציאת התימוס תאי T נאיביים כ. עם זאת, לפוף של התימוס מתחיל מוקדם בחיים המובילים לתפוקה מופחתת באופן אקספוננציאלי של תאי T הנאיביים שהיא פוסט-התבגרות כמעט כבויה 10. עם זאת, בגודל של בריכת תא T נשאר קבוע לאורך כל חיים, שיכול להיות מוסבר רק בחלקו על ידי התפשטות פוסט-הרתי homeostatic של תאי T וההתפשטות של זיכרון חיסוני הארוך חי 11. כתוצאה מכך, חייבת להתרחש התפתחות תאי T extrathymic. מחקר שנערך לאחרונה צבר משיכה משמעותית שאפיינה את אבות תא αβT, אשר-בextrathymic אתרים-הולידו αβ התפקודי תאי T 12-17. עם זאת, ידע מפורט על מבשרי תא αβT extrathymic שעצמאיים מהתימוס להתמיין לתאי αβT הוא מקוטע כמו הרקע שיש לנו במסלול שהם לוקחים ובכך. לאחרונה זיהו את ישות תא T הקטנה של Vδ1 + </sup&gt; תאי CD4 + γδT כprognitor extrathymic αβT תא 18, שכאשר מבודדים מהדם היקפי של תורמים אנושיים בריאים יכול transdifferentiate לתאי αβT בסביבה דלקתית קלה. מעניין ובניגוד לתרבות הומיאוסטטית של תאי T פוסט-הרתי, transdifferentiation של Vδ1 CD4 + תאים מייצר קולטנים תא T חדשים, ובכך להרחיב את מגוון הרפרטואר, כך שיכולים להיות מוכרים אנטיגנים חדשים פוטנציאלי והוא רשאי הגנת המארח מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. זה מוסיף לגמישות של תאי T ומוסיף עד כה שלא מעריך את מסלול חדש לפיתוח תא T extrathymic. בידוד כמותית ממקורות ימפוציטית, הדור של שיבוטים תא בודד וההרחבה היעילה שלהם הם חיוניים למטרה לזהות את אותם סמנים ומולקולות המפעילים תא αβT זה precursor`s פיתוח extrathymic.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

התימוס, האיבר העיקרי לייצור תאי T αβ ועמוד השדרה של המערכת החיסונית אדפטיבית בבעלי חוליות, כבר מזמן נחשב כמקור היחיד של תאי αβT. ובכל זאת, לפוף הרתי מתחיל מוקדם בחיים מובילים לתפוקה מופחתת באופן דרסטי של תאי αβT נאיביים לפריפריה. עם זאת, גם בני מאה יכולה לבנות חסינות מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. המחקרים אחרונים מצביעים פיתוח תא αβT extrathymic, אולם ההבנה שלנו של מסלולים שעשויות לפצות על אובדן הרתי של פונקציה עדיין rudimental. תאי T γδ הם לימפוציטים מולדים המהווים תת-הקבוצה T-cell העיקרי ברקמות. לאחרונה ייחסו פונקציה מצטיינת עד כה שלא מעריכים לקבוצת משנה תא T γδ ידי מראה כי הישות נדירה של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T יכולים transdifferentiate לתאי αβT במצבים דלקתיים. כאן, אנו עמ &#39;rovide הפרוטוקול לבידוד של אב זה מהדם היקפי והטיפוח הבא שלה. תאי Vδ1 מועשרים באופן חיובי מPBMCs של תורמים אנושיים בריאים באמצעות חרוזים מגנטיים, ואחריו שלב שני שבו אנו ממקדים את החלק יחסי הנדירים של תאי CD4 + עם טכניקת תיוג מגנטית נוספת. הכוח המגנטי של התיוג השני עולה על אחד מהתווית המגנטית הראשונה, ובכך מאפשר את הבידוד החיובי יעיל, כמותי וספציפי של האוכלוסייה של עניין. לאחר מכן, אנו מציגים את מצב הטכניקה והתרבות הנדרש לשיבוט וביעילות הרחבת התאים ולזיהוי של השיבוטים שנוצרו על ידי ניתוח FACS. לפיכך, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לטיהור, התרבות והרחבת vivo לשעבר של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T. ידע זה הוא תנאי הכרחי ללימודים הקשורים לביולוגיה progenitor`s תא αβT זה ועבור מי ששואף לאיידntify גורמים המולקולריים המעורבים בtransdifferentiation.

איור 1 מתאר את השלבים השונים ואת התוצאה של הבידוד של תאי T Vδ1 מהדם היקפי. איור 1 א מציג התפלגות טיפוסית של Vδ1 + תאים לימפוציטים בCD3 +, כמו גם ביטוי שיתוף קולט של אוכלוסיית Vδ1 +. בתורם זה, תדירות Vδ1 + תאים (אדום) היא 2.3% מכלל ספירת הלימפ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K Views.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Video: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Developmental Biology

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

הרחבה והעשרה של תאי T של גמא-דלתא (γδ) ממוצר אנושי כדורי

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Cancer Research

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

חקירת הסתיידות שסתום אבי העורקים באמצעות בידוד ותרבות של לימפוציטים T באמצעות תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה לאיתור מיקרו-דומיינים Ca2+ בתאי T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חשיפת ההפעלה הראשונית של התגובה החיסונית הנרכשת להתערבות טיפולית

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca2+ בתאי T ראשוניים

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

ובידוד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

הרחבה והעשרה של תאי T של גמא-דלתא (γδ) ממוצר אנושי כדורי

העכבר נאיבי CD4

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

חקירת הסתיידות שסתום אבי העורקים באמצעות בידוד ותרבות של לימפוציטים T באמצעות תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca²⁺ בתאי T ראשוניים

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca²⁺ בתאי T ראשוניים

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca²⁺ בתאי T ראשוניים