סינתזה של כמעט אינפרא-אדום פליטת מזהב ננו אשכולות עבור יישומים ביולוגיים

זהו פרוטוקול פשוט לסינתזה של פונקציונלי, כמעט אינפרא אדום פולט nanoclusters זהב פוטולומינסנט וזיהוי שלהם באמצעות התקנה מסחרית. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא כי ההחזקה של ליגנד פונקציונלי thiol ואת הצימוד של ליגנד פונקציונלי אמין על פני השטח של nanoclusters זהב אינו משפיע לרעה על תכונות photoluminescent ויציבות סליל. ניתן לדמיין כי השילוב של תכונות פוטולומינציה אינטנסיביות והדבקה עם ביומולקולים יאפשר זיהוי במבחנה של אנילידים בריכוז נמוך, רגישות ביולוגית, מסיסים וביו-הדמיה.

הפגנת ההליך תהיה קלאודיה קווקובה, תלמידת הדוקטורט שלי. ציטומטריית הזרימה תוכח על ידי עוזרת המחקר אלזבטה מגדולנובה. החלק המיקרוסקופי יוצג על ידי ואצלב בוקאן, סטודנט לתואר שני ממעבדת לנקה ליבוסובה.

התחל על ידי הוספת 7.8 מיליגרם של חומצה תיוקטית ב 60 microliters של שני טוחנת נתרן הידרוקסיד ל 23.4 מיליליטר של מים אולטרה-חמים ומערבבים את התערובת עד מומס לחלוטין. לאחר מכן להוסיף 10.2 microliters של מימן tetrachloraurate לפתרון, לאחר 15 דקות, להוסיף 480 microliters של נתרן בורוהידריד מוכן טרי תוך ערבוב במרץ. ממשיכים לבחוש את תערובת התגובה בן לילה.

ביום שלמחרת, לטהר את הפתרון באמצעות שלושה מחזורים של אולטרה סינון עם ניתוב משקל מולקולרי של שלושה קילודלטון, ולאחר מכן להוסיף 15.6 מיליגרם של פוליאתילן גליקול סיים תיול לפתרון, להתאים את ה- pH בין 7 ל 7.5, ומערבבים את התערובת לילה כדי לקבל nanocluster 1. למחרת, לחזור על שלושת המחזורים של צנטריפוגה וסינון כדי לטהר את הפיזור. מערבבים את פתרון nanocluster 1 עם TPP, ולאחר מכן להתאים את ה-pH ל 4.5 עם מימן כלורי אחד טוחן.

התחל את התגובה על ידי הוספת עודף של HCL EDC ולפקח על ה- pH של התערובת במשך השעה הראשונה. אם ה- pH עולה מעל שש, להפחית אותו על ידי הוספת מימן כלורי. מערבבים את תערובת התגובה לילה בטמפרטורת החדר.

ביום שלמחרת, לבצע שלושה מחזורים של צנטריפוגה וסינון כפי שתואר בעבר כדי להשיג nanocluster 2. לדלל 2 עם מים אולטרה-חמים לנפח של 24 מיליליטר. זרע את התאים בצלחת 12 באר בצפיפות של 20, 000 תאים לגם.

להדגיר אותם במשך 48 שעות, ולאחר מכן לשאיף את המדיום ולהוסיף 400 microliters של מדיום תרבות מלאה עם או בלי 500 מיקרוגרם של חלקיקים לגם. החזירו את התאים לאנקובטור של 37 מעלות צלזיוס להפנמה של ננו-קלאסטר. לאחר שעתיים, נתק את התאים באמצעות טריפסיניזציה סטנדרטית.

לאסוף אותם צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן וצנטריפוגה במשך חמש דקות ב 350 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. הכן מאגר FCM על פי הוראות כתב היד ולהשתמש מיליליטר אחד של המאגר לשטוף את כדורי התא. צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות נוספות, ולאחר מכן resuspend אותם 500 microliters של מאגר FCM ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס.

לפני רכישת המדגם, ודא שלמכשור יש את התצורה האופטית המתאימה. מניחים את מסנן 780 על 60 bandpass מול גלאי 405A. סנן את כל הדגימות באמצעות צינור עם תחתית מעוגלית של חמישה מיליליטר עם כובע מסננת תאים.

ציין את תצורת הציטרומטר. התווה התוויית נקודה של שני פרמטרים של FSC-A ו- SSC-A כדי להציג התפלגות תאים. כדי לא לכלול כפילויות, צור תרשים נקודה בן שני פרמטרים של FSC-H לעומת FSC-A והתווה היסטוגרמה של פרמטר יחיד עבור אזור הערוץ הפלואורסצנטי כדי לפקח על עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית המדגם.

השג מדגם לא מטופל בקצב זרימה נמוך כדי למזער אירועים מקריים. במהלך הרכישה, התאם את מתחי PMT כדי לקבל את האוכלוסייה לא מטופלת בקנה מידה על העלילה FSC לעומת SSC. במידת הצורך, כוונן את מתחי PMT עבור ערוץ FL כדי למקם את האוכלוסייה שאינה מוכתמת בפינה השמאלית של ההיסטוגרמה.

לאחר מכן בחר את הכרטיסיה שער ספציפית בתוכנה ולצייר שער מתאים סביב האוכלוסייה הרצויה. התאים בתוך השער יעברו למחסום הבא. כוונן את הניסוי ותקליט את הנתונים.

ב 24 שעות לאחר הזריעה, להוסיף 100 מיקרוגרם של 2 לכל תא כלים המכיל 0.5 מיליליטר של בינוני עם תאי HeLa. מחזירים את המנה לחממה ומאפשרים לתאים להפנים את הננו-קלסטרים, ואז להשליך את המדיום ולשטוף את התאים במדיום טרי לפני המלחמה. מלאו כל תא ב-800 מיקרוליטרים של מדיום טרי והמשיכו בהדמיה.

כדי לדמיין את התאים, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל עם Plan-APOCHROMAT ועדשה אובייקטיבית שמן 63x. הר את המנה על הבמה ההפוכה עם התא התחמם עד 37 מעלות צלזיוס וסיפק עם לחות, 5% פחמן דו חמצני אטמוספירה. זהה nanoclusters זהב הפנימו באמצעות לייזר 405 ננומטר להגדיר 2% כוח עם מפצל קרן מתאים, הגדרת טווח אורכי גל זיהוי בין 650 ו 760 ננומטר.

הגדר את הרזולוציה של התמונה ל- 2048 עד 2048 פיקסלים. בהגדרת מהירות הרכישה, כוון לזמן השתהות של פיקסלים סביב ארבעה מיקרו-שניות ורכוש את התמונה עם ממוצע של פי שניים, ולאחר מכן הגדר את חור הסיכה ליחידת שטח אחת, ולרגישות גבוהה יותר, השתמש במצב ספירת הפוטונים. לתאורה נכונה ואור משודר עם DIC השתמש בהגדרה של Kohler של מעקץ ועצירת שדה.

כדי להשיג אור משודר, השתמש בלייזר 488 ננומטר בה הספק של 0.7% ללא כל גלאי פלואורסצנטי שהוקצה, הקפד להגדיר מפצל קרן מתאים לאורך גל הלייזר. ספקטרום ספיגה הצביע על כך nanoclusters זהב 1 ו 2 אין רצועת פלסמון משטח אופייני להראות פליטה רחבה מ 550 כדי 850 ננומטר. פוטולומינציה גדלה מאוד לאחר התקשרות של TPP על פני השטח של 1.

פליטה מן nanoclusters היה גלוי גם תחת אור UV 365 ננומטר. הפליטה הייתה יציבה ואורך הגל שלה היה בלתי תלוי באורך גל העירור, אך העוצמה הייתה מקסימלית כאשר התרגשו עם אור UV. ציטומטריית זרימה שימשה לאישור ספיגת nanocluster 2 על ידי תאי HeLa.

כמעט פלואורסצנטיות הייתה תלויה הן בזמן הדגירה והן בריכוז של ננו-קלאסטר 2. הננו-בלייזרים הזהובים בתוך התאים דימויו באופן לא פולשני עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי סטנדרטי. התאים היו מוכתמים בננוקלוסטר 2, ולאחר 24 שעות של דגירה, פוטולומינציה אדומה בוהקת נצפתה בתוך התאים.

בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי הסרת נתרן בורוהידריד לא מנוגד והידרוליזה חשוב מאוד, אחרת פוליאתילן גליקול thiolated לא ייקשר לפני השטח של ננוקלאסטר זהב. בנוסף, פוטולומינציה של nanoclusters זהב מתחיל מ 560 ננומטר. כדי למנוע את השפע האוטומטי ברקע בניסויי מיקרוסקופיה קונפוקלים, יש לאסוף את הפוטונים מעל 650 ננומטר.