이것은 기능화 가능한 근적외선 발광 광발성 금 나노 클러스터의 합성과 상업적 설정을 사용하여 검출을위한 간단한 프로토콜입니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 티올 기능성 리간드의 부착과 금 나노 클러스터의 표면에 아민 기능성 리간드의 결합이 광발성 특성 및 코일 안정성에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 강렬한 광발광 특성과 생체 분자와의 융합의 조합이 저농도 아닐리드, 생체 감지, 용해 성 및 바이오 이미징의 체외 검출을 허용할 것이라고 상상할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 클라우디아 Kvakova, 내 박사 과정 학생입니다. 유동 세포측정은 연구 조수 알츠베타 마그돌노바에 의해 입증될 것입니다. 현미경 부분은 바츨라프 보칸에 의해 입증될 것입니다, 렌카 Libusova 실험실에서 졸업생.
먼저 2개의 어금니 나트륨 수산화나트륨 60마이크로리터에 7.8밀리그램의 투옥산을 초순수 수산화물의 23.4 밀리리터에 추가하고 완전히 용해될 때까지 혼합물을 저어줍니다. 다음으로 10.2 마이크로리터의 수소 테트라클로라리테를 용액에 추가하고, 15분 후에는 갓 준비된 보로하이드라이드 나트륨 480마이크로리터를 넣고 활발하게 저어줍니다. 밤새 반응 혼합물을 계속 저어줍니다.
다음 날, 3킬로달톤의 분자량 컷오프로 3사이클의 초여필을 사용하여 용액을 정화한 다음, 15.6밀리그램의 티올 종단 폴리에틸렌 글리콜을 용액에 넣고, pH를 7~7.5로 조정하고, 나노클러스터 1을 얻기 위해 밤새 혼합물을 저어줍니다. 다음 날, 분산을 정화하기 위해 원심분리 및 여과의 세 주기를 반복합니다. 나노클러스터 1 용액을 TPP와 혼합한 다음 pH를 1-대구수소염화와 함께 4.5로 조정합니다.
EDC HCL의 과잉을 추가하여 반응을 시작하고 첫 번째 시간 동안 혼합물의 pH를 모니터링한다. pH가 6이상 증가하면 염화수소를 첨가하여 감소시킨다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 저어줍니다.
다음 날에는, 나노클러스터 2를 얻기 위해 이전에 설명된 바와 같이 원심분리 및 여과의 3주기를 수행한다. 초순수물로 2를 24밀리리터의 부피에 희석시다. 12웰 플레이트에서 잘 12-웰 플레이트에 세포를 잘 한다.
48 시간 동안 배양 한 다음 매체를 흡인하고 우물 당 500 마이크로 그램의 나노 입자가 있거나없는 완전한 배양 배지의 400 마이크로 리터를 추가하십시오. 나노 클러스터 내재화를 위해 세포를 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌려 보겠습니다. 2 시간 후 표준 트립시화로 세포를 분리합니다.
폴리프로필렌 미세 원심 분리기 튜브와 원심분리기에서 350배, 섭씨 4도에서 5분간 수집합니다. 원고 방향에 따라 FCM 버퍼를 준비하고 완충제의 1 밀리리터를 사용하여 세포 펠릿을 세척합니다. 세포를 5분 간 원심분리한 다음 FCM 버퍼의 500마이크로리터로 다시 분리하여 섭씨 4도에 저장합니다.
시료를 획득하기 전에 계측기에 해당 광학 구성이 있는지 확인합니다. 405A 검출기 앞에 780개 이상의 밴드패스 필터를 놓습니다. 셀 스트레이너 캡이 있는 5밀리리터 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브를 사용하여 모든 샘플을 필터링합니다.
사이토미터 구성을 지정합니다. FSC-A 및 SSC-A의 두 매개 변수 점 플롯을 플롯하여 셀 분포를 표시합니다. 더블을 제외하려면 FSC-H 대 FSC-H의 2파라미터 점 플롯을 만들고 형광 채널 영역에 대한 단일 파라미터 히스토그램을 플롯하여 샘플에서 상대형 형광 강도를 모니터링합니다.
일치하는 이벤트를 최소화하기 위해 낮은 유량으로 처리되지 않은 샘플을 획득합니다. 획득 하는 동안 PMT 전압을 조정 하여 FSC 대 SSC 플롯에서 처리되지 않은 인구를 규모로 가져옵니다. 필요한 경우 FL 채널의 PMT 전압을 조정하여 히스토그램의 왼쪽 모서리에 얼룩이 없는 모집단을 배치합니다.
그런 다음 소프트웨어의 특정 게이트 탭을 선택하고 원하는 모집단 주위에 적절한 게이트를 그립니다. 게이트 내부의 셀은 다음 검사점으로 이동합니다. 실험을 설정하고 데이터를 기록합니다.
24 시간 후 파종에서, 추가 100 마이크로 그램 2 HeLa 세포와 매체의 0.5 밀리리터를 포함 하는 각 접시 챔버에 마이크로 그램. 접시를 인큐베이터로 되돌리고 세포가 나노 클러스터를 내면화한 다음 매체를 버리고 예온된 신선한 배지로 세포를 씻을 수 있게 합니다. 각 챔버에 800마이크로리터의 신선한 배지를 채우고 이미징을 진행합니다.
세포를 이미지화하려면 플랜-APOCHROMAT 및 63배 의 오일 목표 렌즈를 사용하여 공초점 현미경을 사용합니다. 반역 된 무대에서 접시를 마운트 챔버는 섭씨 37도까지 따뜻하게하고 가습, 5 % 이산화탄소 대기와 함께 공급. 적절한 빔 스플리터로 2%의 전력으로 설정된 405나노미터 레이저를 사용하여 내재화된 금 나노클러스터를 감지하여 650~760나노미터 사이의 검출 파장의 범위를 설정합니다.
이미지 해상도를 2048픽셀로 설정합니다. 획득 속도 설정에서 픽셀 거주 시간을 4마이크로초 정도목표로 하고 평균 2회로 이미지를 획득한 다음 핀홀을 한 영역 단위로 설정하고 민감도가 높아지면 광자 계수 모드를 사용합니다. DIC를 사용하여 올바른 조명 및 전송된 라이트를 보려면 콜러의 응축기 및 필드 스톱 설정을 사용합니다.
투과된 빛을 습득하려면 형광 검출기가 할당되지 않고 0.7%의 전력으로 488나노미터 레이저를 사용하여 레이저 파장에 적합한 빔 스플리터를 설정하십시오. 흡수 스펙트럼은 금 나노 클러스터 1 과 2 특징적인 표면 플라스몬 밴드가 없으며 550 내지 850 나노미터에서 광범위한 방출을 나타내고 있음을 나타냈다. 1의 표면에 TPP의 부착 후 광발성이 강하게 증가했다.
나노 클러스터에서 방출은 또한 365 나노미터 UV 빛에서 볼 수 있었다. 방출은 안정적이었고 파장은 흥분 파장과 는 독립적이었지만 UV 빛에 흥분했을 때 강도가 극대화되었습니다. 유동 세포측정은 HeLa 세포에 의한 나노클러스터 2 섭취를 확인하기 위해 사용되었다.
거의 형광은 나노 클러스터 2의 잠복 시간 및 농도 모두에 의존했다. 세포 내의 금 나노 클러스터는 표준 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 비침습적으로 이미지화되었다. 세포는 나노클러스터 2로 염색되었고, 24시간 동안 배양한 후, 세포 내부에서 밝은 적색 광발광을 관찰하였다.
이 프로토콜을 시도할 때, 비반응성 및 가수분해나트륨보하이드라이드의 제거가 매우 중요하며, 그렇지 않으면 티오라스트 폴리에틸렌 글리콜이 금 나노클러스터표면에 결합되지 않는다는 것을 기억하는 것이 중요하다. 또한 금 나노 클러스터의 광발광은 560 나노미터에서 시작됩니다. 공초점 현미경 실험에서 배경 자동 형광을 피하기 위해 광자를 650 나노미터 이상으로 수집해야합니다.
