המחברים מבקשים להודות NanoVentures אוסטרליה לתמיכה במימון הנסיעות ופרופ &#39;ג&#39;ון כובע על שארח באופן חלקי מחקר זה באוניברסיטת שפילד והגב&#39; Jaimee Mayne על עזרתה בזמן הצילומים.

1. Au NRS הכנה הערה: יכול להיות מסונתז Au NRS על ידי מספר המתכונים 16, או שנרכש מיצרנים מסחריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הצפיפות הראשונית האופטית (OD) של פתרון Au NR באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis, על ידי הקלטת ערכי הקליטה מ -300 ננומטר עד 1,000 ננומטר עם רזולוציה של 0.5-2 ננומטר. משתנה הנפח של הפתרון לשימוש עם קובט הזמינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הריכוז הראשוני NP טוחנת עם הטכניקה מתאימה 17 (ספקטרוסקופיה למשל UV-Vis, ספקטרומטריית מסת פלזמה בשילוב אינדוקטיבי חלקיק יחיד, מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים) או להשתמש בערכי הריכוז הניתנים על ידי הספק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 5 מיליליטר ידי דילול מדגם Au NR הראשוני להגיע OD = 1. לדירות הטובות ביותר, לשמור קבוע OD לכל הדגימות שנבדקו. עקוב הפרוטוקול של הספק המסחרי להרכב הממס המדלל. אם אינך בטוח, להשתמש במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מיליליטר של פתרון Au NR פעמיים במשך 15 דקות ב7,800 XG כדי להסיר כל עודף כימי מהפתרון. מחזורי צנטריפוגה יכולים להשתנות בכוח והזמן (למשל g × 20 דקות ב 5,600) 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatants מחדש להשעות NRS במים ללא יונים. כחלקיקים מחדש מושעה עלולים ליצור אגרגטים בפתרון, להכין אותם מדי יום כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר. לחלופין, חנות במקרר לא יותר משבוע 1. לא להקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש בתנאי תרבית תאים, sonicate פתרון Au NR למשך 5 דקות ולאחר מכן לחטא עם אור UV למשך 30 דקות (עוצמת קרינת UV לא פחות מ -400 mW ∙ m -2 ב 254 ננומטר). </li></ol> תרבות קו 2. NG108-15 תאים עצביים ובידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדיום תרבית תאים, להכין 500 מיליליטר של המדיום של Dulbecco סטרילי שונה נשר (DMEM) המכיל 10% (w / v) בסרום עגל עוברי (FCS), 1% (w / v) L- גלוטמין, 1%(W / v) (w / v) ב amphotericin פניצילין / סטרפטומיצין ו -0.5% יכולים להיות aliquoted תוספי, מאוחסנים ב -20 ° C והוסיפו לתקשורת ביום נדרש: הערה. מדיום תרבות תא יכול להיות בקירור במצב סטרילי לתקופה מקסימלית של 1 חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבינוני התמיינות תאים, להכין 50 מיליליטר של DMEM סטרילי המכיל 1% (w / v) L- גלוטמין, 1% (w / v) (w / v) ב amphotericin פניצילין / סטרפטומיצין ו -0.5% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול NG108-15 תאים עצביים ב 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים בצלוחיות T75 עשויים קלקר באינקובטור עם אווירת humidified (5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס). בדרך כלל, זרע 1.5-2 × 10 5 תאים בבקבוק אחד כדי להיות מוכן ב3-4 ימים. שנה בינוני תרבית תאים בכל יומיים. הערה: כדי למנוע סחף או וריאציה גנטיים, לא משתמש בתאים מבוגרים יותר ממעבר 21 לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ומחוברות 70-80% בתרבות, לשנות בינוניות עם בינוני תרבות תא חם וטריה. מכאני לנתק את התאים על ידי בעדינות knocהמלך התחתון של הבקבוק ומחוברות. אל תשתמש בטריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 5 דקות ב 600 XG מחדש להשעות את התא גלולה ב 2 מיליליטר של מדיום התמיינות תאים חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 × 10 4 תאים / סנטימטר זרע 2 בצלחת גם קלקר תרבית רקמת 96 עם 200 μl של מדיום התמיינות תאים. דגירה הניסוי ליום 1 בשעה 5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בין 3.2 × 10 9 -4.2 × 1 0 10 / חלקיקי מיליליטר של תמיסת Au NR ביום 2 ודגירה אותו למשך 24 שעות נוספות. אל תוסיף את החלקיקים לניסויי שליטה. הערה: כפי ששליטה חלופית, Au צירופים ועם אורך גל קליטת שיא היטב הבדיל יכולים לשמש למטרות השוואה 14. להתנהגות תא עקבית יותר, לשמור על צפיפות תאים קבועים ולא לשנות את פני השטח היטב לפני זריעת תאים. </li></ol> 3. neurite תולדה שיפור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוגהלייזר עם סיב אופטי מצב יחיד (צמצם המספרי = 0.13) ולסיים אותו עם מחבר סיבים (המחברים FC נוחים וזמינים בדרך כלל). מדוד את כוח לייזר פלט עם מד כוח סטנדרטי. כדי להשיג את התוצאות האפקטיביות ביותר, להתאים את אורך הגל לשיא של הלייזר לשיא תהודת plasmon של NRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 הדגירה NR הבאה, לתקן את מחבר FC לטוב. מכשיר את דגימות ובקרות בRT דקות 1 בגל רציף, לסמכויות לייזר שונות. לאפשר לתרבות כדי להמשיך במשך 3 ימים נוספים בבית 5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. חזור על הקרנת הלייזר למינימום של 3 מדידות עצמאיות. הערה: זמני הקרנה שונים ותדרי דופק ניתן לבחור, בהתאם ליישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את הלייזר במונחים של קוטר האלומה וirradiance לייזר (W ∙ סנטימטרים -2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיבי מצב יחידים סטנדרטיים, להשתמש = n ∙ θ חטא NA,כאשר n הוא מקדמת השבירה של המדיום בשימוש וθ הוא זווית המחצית מחרוט אור יציאה מהסיבים (ראה איור 1 א). מטריגונומטריה, r = d θ ∙ שיזוף, שבו r הוא רדיוס הקורה וd הוא המרחק בין הסיבים והמדגם. מחבר FC תואם את הקוטר של באר, ולכן מאיר את המדגם במרחק d = 2.70 ± 0.20 מ&quot;מ. אור יוצא הסיבים במים (n = 1.33), נותן r = tan (חטא-1 (NA / n)) ∙ ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המשוואה האחרונה, לחשב את רדיוס קרן לייזר, קרן האזור המתאים וirradiance הממוצעת הלייזר (כוח הלייזר מחולק באזור קרן) ביעד (ראה גרף הדוגמא באיור 1). ערכים אלה מייצגים irradiance הממוצעת מעל האזור המואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הטעויות למדידות עם התאוריה הכללית של התפשטות שגיאה. הערה: b המרחקetween מחבר FC והמדגם ניתן למדוד בתצלומיו של ההסדר הניסיוני ולאחר העיבוד של התמונה באמצעות תוכנה מתאימה (למשל ImageJ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, להסיר בינוני התמיינות תאים מהניסויים ולתקן את הדגימות עם 3.7% (v / v) פתרון פורמלדהיד במשך 10 דקות, ולאחר מכן permeabilize התאים עם 0.1% (v / v) טריטון X-100 עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) על הדגימות עבור 60 דקות כדי לחסום את חלבון unreacted אתרי קישור. תווית הדגימות ללילה אנטי-βIII טובולין (5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS בתוספת 1% מBSA) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 90 דקות בחושך עם נוגדנים משני מתאימים (אנטי עכבר נוגדני IgG למשל TRITC-מצומדות) באמצעות ריכוז של .4-2 מיקרוגרם / מיליליטר בBSA 1% ב- PBS. תווית גרעין התא עם DAPI (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר מים דה מיונן ב) במשך 10 דקות. הערה: נטיית נוגדן ומיג ריכוזht להשתנות בהתאם לפרוטוקול החברה. לשטוף דגימות עם PBS פעמיים במשך 5 דקות לאחר כל שלב צביעה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה על ידי epifluorescence או confocal באמצעות לפחות 20 × אובייקטיביים. בחר מיקרוסקופ מסננים בהתאם לנוגדנים משני. בחר מסנן DAPI (λ = 358 nm EX; λ EM = 488 ננומטר) כדי להמחיש את גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התמונות על ידי הערכה: i) האורך המרבי neurite (שיא האורך מקצה neurite לתחילת גוף התא), ii) מספר neurites לכל תא עצבי (לסכם את כל neurites לכל תא) וiii) את אחוז התאים עם neurites (לחלק את המספר הכולל של תאים לבטא βIII טובולין במספר הכולל של תאים בעלי גרעין מוכתם חיובי) 19. </li></ol> 4. בלייזר מושרה ההדמיה 2 + תאיים Ca <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20% (w / v) פתרון מניות של pluronic F-127 על ידי המסת 2 גרם של מומס ב 10 מיליליטר של sulfoxide נטול מים דימתיל (DMSO). מחממים את הפתרון של pluronic F-127 ב 40 מעלות צלזיוס במשך כ -20 דקות כדי להגדיל את המסיסות. להכין אותו מראש אם הם נמצאים בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 הבאים דגירה NR, להכין תמיסת מלח מאוזנת (BSS; 135 מ&quot;מ NaCl, 4.5 מ&quot;מ KCl, 1.5 מ&quot;מ CaCl 2, 0.5 מ&quot;מ MgCl 2, 5.6 גלוקוז מ&quot;מ, ו -10 מ&quot;מ HEPES, pH 7.4) והשלים אותו עם 5 מיקרומטר של Fluo-4 בבוקר ובDMSO 0.1% (w / v) של פתרון pluronic F-127. הערה: פתרון BSS יכול להיות מוכן מראש וקירור לתקופה מקסימלית של 1 חודש. הוסף את התוספים (Fluo-4 בבוקר וpluronic F-127) ביום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני התמיינות תאים ולהחליף אותו עם פתרון BSS בתוספת. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עם מיקרוסקופ confocal הפוך, דגירה התאים במייקרו-שקופית היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס NG108-15 עם Fluo-04:00למשך 30 דקות בחושך ב5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. בעקבות זמן הדגירה, לשטוף דגימות פעמיים עם BSS כדי להסיר כל fluorophore טעון תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג הלייזר עם סיב אופטי במצב בודד, ודבק בקצה תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית. שים לב לקצה וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ אופטי, על מנת להבטיח איכות גבוהה משטח (כלומר הקצה צריך להיות בניצב לציר הסיבים ושטוח על בדיקה מיקרוסקופית). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את כוח לייזר פלט עם מד כוח סטנדרטי. הכנס את סיבי משלוח האור לבעל סיבים אופטיים ולהדביק אותו לmicropositioner. עיין באל בראון ואח. 20 לפרטים נוספים על הכנת סיבים אופטית ומיצוב. זהירות: בצע את הכללים לבטיחות לייזר במהלך המדידה של כוח הלייזר (למשל לא נראים ישירות לתוך קרן לייזר, לחבוש משקפי מגן בטיחות הלייזר במהלך טיפול, מניעת חשיפה לאור תועה למשתמשי מעבדה אחרים) &lt;./ Li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אוסצילוסקופ לליזר הנייד כדי לפקח על האפנון האופטי. השתמש באות בינארי עם תדרים משתנים (0.5-2 הרץ) ואורכי דופק (20-100 אלפיות שני). חבר הלייזר באמצעות אות האפנון כהיגיון טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) קלט למיקרוסקופ, לאחר ההתקנה מוצגת בet al Paviolo. 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים תחת מיקרוסקופ confocal הפוך ולמקם את סיבי משלוח אור 250 ± 50 מיקרומטר מתא המטרה במצב תאורת שידור. במרחק זה, להשתמש במשוואות שהוצגו ב3.3.1 לחשב את רדיוס הקרן ביעד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בליזר ארגון-יון (488 ננומטר) כדי לעורר את צבע AM Fluo-4 הפנים (λ = 494 nm EX; λ EM = 516 ננומטר) וLD המסונכרן לעירור של NRS endocytosed. לבצע ההדמיה בRT של דגימות ובקרה באמצעות לפחות אובייקטיבי 40 × ידי איסוף סריקות בזמן סדרהעם 256 × 256 פיקסלים / רזולוציה מסגרת במצב הלוך ושוב בתדירות של לפחות 4 הרץ. לבצע הקלטה ללא כל עירור LD לזהות כל הפרעה ארגון יון לייזר (רעש בסיס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרקע מנתונים באמצעות משוקלל adaptively אלגוריתמי הריבועים הפחותים נענשו 21. העלילה Ca 2 + וריאציות המושרית כפונקציה של זמן. לנתח את הפסגות חולפות בעוצמת הקרינה באמצעות תוכנה שלאחר עיבוד תמונה על ידי thresholding ברמה שלוש פעמים סטיית התקן של רעש הבסיס (3σ). </li></ol>

<ol>
	<li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stimulation+with+optical+radiation.">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).</li><li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes.">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).</li><li>Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+ion+channels+and+neurons+through+magnetic-field+heating+of+nanoparticles.">Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles.</a> Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).</li><li>Farah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographically+patterned+activation+using+photo-absorber+induced+neural-thermal+stimulation.">Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation.</a> J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).</li><li>Ciofani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+neuronal-like+cells+following+boron+nitride+nanotube-mediated+stimulation.">Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation.</a> ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+by+iron+oxide+nanoparticles.">Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).</li><li>Myroshnychenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+optical+response+of+gold+nanoparticles.">Modelling the optical response of gold nanoparticles.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).</li><li>Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+cancer+therapy+and+imaging+based+on+gold+nanorods.">Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).</li><li>Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+mesoporous+silica-encapsulated+gold+nanorods+as+enhanced+light+scattering+probes+for+cancer+cell+imaging.">A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging.</a> Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).</li><li>Paviolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+increase+neuronal+cell+outgrowth.">Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).</li><li>Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+induce+intracellular+calcium+transients.">Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients.</a> J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).</li><li>Yong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-nanorod-assisted+near-infrared+stimulation+of+primary+auditory+neurons.">Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons.</a> Adv. Healthcare Mater. , (2014).</li><li>Eom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+infrared+neural+stimulation+using+localized+surface+plasmon+resonance+of+gold+nanorods.">Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods.</a> Small. , (2014).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+Synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications.</a> Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+separation+of+gold+nanorods+using+centrifugation.">Shape separation of gold nanorods using centrifugation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).</li><li>Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+site+influences+the+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells+for+schwann-cell+phenotype+and+function.">Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function.</a> Glia. 59 (5), 734-749 (2011).</li><li>Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+for+investigating+the+mechanisms+of+infrared+neural+stimulation.">Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation.</a> JoVE. (77), (2013).</li><li>Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+fluorescence+background+subtraction+from+Raman+spectra.">Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra.</a> J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).</li><li>Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aligned+3D+neuronal-glial+co-culture+model+for+peripheral+nerve+studies.">An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies.</a> Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+gold+nanoparticles+increase+neuronal+excitability+and+aggravate+seizure+activity+in+the+mouse+brain.">Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain.</a> PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).</li><li>Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+extracellular+application+of+gold+nanostars+increases+hippocampal+neuronal+activity.">Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity.</a> J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).</li><li>Ebbesen, C. L., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+laser-induced+heating+in+optical+neuronal+guidance.">Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance.</a> J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).</li><li>Iwanaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location-dependent+photogeneration+of+calcium+waves+in+HeLa+cells.">Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+minimum+temperature+required+for+selective+photothermal+destruction+of+cancer+cells+with+the+use+of+immunotargeted+gold+nanoparticles.">Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles.</a> Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).</li><li>Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+are+taken+up+by+human+cells+but+do+not+cause+acute+cytotoxicity.">Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity.</a> Small. 1 (3), 325-327 (2005).</li><li>Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subacute+and+chronic+toxicity+of+cetyltrimethylammonium+bromide+(CTAB),+a+cationic+surfactant,+in+the+rat.">The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat.</a> Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: synthesis, characterization and applications.</a> Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+golden+age:+gold+nanoparticles+for+biomedicine.">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+photothermal+therapy+(PPTT)+using+gold+nanoparticles.">Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles.</a> Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).</li><li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons.">TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).</li><li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent+rearrangement+of+TRPV4+cytosolic+tails+enables+channel+activation+by+physiological+stimuli.">Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), (2012).</li><li>Roggan, A., Friebel, M., D&#246;rschel, K., Hahn, A., M&#252;ller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm.">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=810+nm+wavelength+light:+an+effective+therapy+for+transected+or+contused+rat+spinal+cord.">810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord.</a> Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).</li><li>Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=780+nm+low+power+diode+laser+irradiation+stimulates+proliferation+of+keratinocyte+cultures:+involvement+of+reactive+oxygen+species.">780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species.</a> Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).</li><li>Wong-Riley, M. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+directly+benefits+primary+neurons+functionally+inactivated+by+toxins+-+Role+of+cytochrome+c+oxidase.">Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).</li><li>Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+mitochondrial+compartment+to+the+optical+properties+pf+the+rat+liver:+a+theoretical+and+practical+approach.">Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach.</a> Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

הפרוטוקולים מפורטים במצגת זו מתארים כיצד תרבות, להבדיל ואופטי לעורר תאים עצביים באמצעות בולמים חיצוניים. מאפייני NR (למשל ממדים, צורה, אורך גל תהודת plasmon וכימיה של פני השטח) ופרמטרי גירוי לייזר (כגון אורך גל, אורך הפולס, שיעור החזרה, וכו &#39;) יכולים להיות מגוון ?...

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי החימום החולף הכרוכות בקליטה של אור אינפרא אדום על ידי מים (אורך הגל&gt; 1,400 ננומטר) ניתן להשתמש כדי לגרום לפוטנציאל פעולה ברקמת עצב 1 וארעי סידן תוך תאי בשריר לב 2. השימוש באור אינפרא אדום העלה עניין רב עבור יישומים בתותבות עצביות, בשל הרזולוציה מרחבית עדינה הפוטנציאל, חוסר מגע ישיר עם הרקמות, מזעור של חפצי גירוי, והסרת הצורך לשנות גנטי את התאים לפני הגירוי ( כפי שנדרש בoptogenetics) 1. למרות כל היתרונות הללו, מודלים תרמיים שפותחו לאחרונה הציעו כי רקמת התאים / היעד עשויים להיות מושפעים מהשפעות מצטברות חימום, כאשר אתרי גירוי מרובים ו / או שיעורים גבוה חזרה משמשים 3,4. בתגובה לאתגרים אלה, חוקרים זיהו את הפוטנציאל לשימוש חיצוני absorbers לגירוי עצב לייצר אפקטי חימום מקומיים יותר ברקמה. הואנג et al. הוכיח את העיקרון הזה על ידי שימוש בננו-חלקיקי פרית פאראמגנטי להפעיל מרחוק ערוצי TRPV1 רגיש לטמפרטורה בתאי HEK 293 עם תדר רדיו שדה מגנטי 5. למרות שטכניקה זו עשויה לאפשר לחדירה עמוקה יותר (שדות מגנטיים מגיבים יחסית חלש עם רקמה), התגובות נרשמו רק על פני תקופות של שניות, ולא המשכים אלפית השנייה הנדרשים במכשירי יונית 5. באופן דומה, פרח et al. גירוי חשמלי של תאי עצב בקליפת המוח הראה עכברוש עם מיקרו-חלקיקים שחורים במבחנה. הם הראו דיוק ברמת תא בגירוי באמצעות משכי דופק בסדר הגודל של מאות מייקרו-שני ואנרגיות בטווח של μJ, פוטנציאל המאפשרים לשיעורי חזרה מהירים יותר 6. השימוש בבולמים חיצוניים גם הוחל לגרוםשינויים מורפולוגיים במבחנה. Ciofani et al. הראה עלייה ~ 40% בתולדת תאים עצביים באמצעות צינורות ניטריד בורון פיזואלקטריים נרגשים על ידי אולטרסאונד 7. בדומה לכך, חלקיקי תחמוצת ברזל endocytosed בתאי PC12 כבר דיווח על מנת לשפר את בידול neurite באופן תלוי מינון, בשל הפעלת מולקולות הידבקות תא עם תחמוצת ברזל 8. לאחרונה, העניין בבולמים חיצוניים כדי לסייע גירוי עצבי גם התמקד בשימוש בננו-חלקיקי זהב (NPS Au). יש צירופים וAu היכולת לספוג ביעילות אור הלייזר בשיא plasmonic וכדי להפיג אותו לסביבה בצורה של חום 9. בין כל צורות חלקיקים הזמינות, הקליטה האופטית של ננו זהב (Au NRS) במקום נוח תואמת את החלון הטיפולי של רקמות ביולוגיות (ליד אינפרא אדום - ניר, גל בין 750-1,400 ננומטר) 10. יתר על כן, בהמשךשלוחה של גירוי עצבי, השימוש בAu NRS מספק biocompatibility נוח יחסית ומגוון רחב של אפשרויות functionalization משטח 11. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי השפעה ממריצה על בידול יכולה להיגרם לאחר חשיפת לייזר רציפה של Au NRS בNG108-15 תאים עצביים 12. באופן דומה, הארעיים סידן תוך תאי נרשמו בתאים עצביים תרבית עם Au NRS אחרי הקרנת הלייזר מווסתת עם תדרים ודופק משתנים אורכי 13. שלילת קוטביות קרום תא נרשמה גם לאחר תאורת לייזר NIR של Au NRS בתרבויות עיקריות של נוירונים הגנגליון ספירלה 14. הראשון ביישום vivo עם מוקרן Au NRS הודגם רק לאחרונה. משקיפים ועמיתים לעבודה נחשפו Au NRS בשיא plasmonic ונרשמו עלייה של פי שש במשרעת של פוטנציאל פעולה עצבי מתחם (CNAPs) וירידה של פי שלושה בסף הגירוי בעצבי sciatic חולדה. Enתגובה חל שיפורים יוחסה להשפעות חימום מקומיות כתוצאה מהעירור של שיא plasmonic NR 15. בעבודה הנוכחית, פרוטוקולים לבודקים את ההשפעה של גירוי הלייזר בNG108-15 תאים עצביים תרבית עם NRS Au מפורטים. שיטות אלה מספקות, דרך פשוטה, אך רבת עוצמה כדי להקרין אוכלוסיות תאים במבחנה תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות סטנדרטיים וחומרים. הפרוטוקול מבוסס על דיודות לייזר בשילוב סיבים (LD), המאפשרת הפעלה בטוחה ויישור הדיר. שיטות הקרנת הכנת מדגם ולייזר Au NR ניתן להאריך עוד יותר לצורות שונות של חלקיקים ותרביות תאים עצביים, ובלבד שפרוטוקולי הסינתזה והתרבות הספציפיים ידועים, בהתאמה.

<table><tbody><tr><td>Au NR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>716812</td><td></td></tr><tr><td>NG108-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8811230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life Technologies</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Life Technologies</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;III-tubulin</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5393</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Varian Medical Systems Inc.</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Mini Spin</td><td></td></tr><tr><td>Sonic bath</td><td>Unisonics Australia</td><td>FPX 10D</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Kendro</td><td>Hera Cell 150</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotofix 32A</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Optotech</td><td>780 nm single mode fibre - coupled LD</td><td></td></tr><tr><td>Optical fiber</td><td>Thorlabs</td><td>780 HP</td><td></td></tr><tr><td>Power meter</td><td>Coherent</td><td>Laser Check</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Axon Instruments</td><td>ImageX-press 5000A</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-slide well</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy Ltd.</td><td>LSM 510 meta-confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS210</td><td></td></tr></tbody></table>

gold nanorod-assisted optical stimulation of neuronal cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

על ידי שימוש בפרוטוקולים 1, 2, ו -3 שתוארו כאן, השפעה ממריצה על בידול נצפתה בNG108-15 תאים עצביים תרבותיים עם הצירופים וAu (NRS Au, פולי (styrenesulfonate) -coated Au NRS והמצופה סיליקה Au NRS) לאחר לייזר חשיפות בין 1.25 ו -7.5 W · סנטימטר -2. תמונות Confocal של NRS Au כותרת rhodamineB הראו כי החלקיקים הופנמו מ...

Watch this Scientific Journal Video about Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells at JoVE.com

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

gold-nanorod-assisted-optical-stimulation-of-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Swinburne University of Technology. This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Video: Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

באמצעות מערכי LED משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into glass capillaries, pulled to a fine taper, and then sealed using an epoxy to create electrode materials that are used for fast scan cyclic voltammetry testing. The use of bare CFMEs has several limitations, though. First and foremost, the carbon fiber contains mostly basal plane carbon, which has a relatively low surface area and yields lower sensitivities than other nanomaterials. Furthermore, the graphitic carbon is limited by its temporal resolution, and its relatively low conductivity. Lastly, neurochemicals and macromolecules have been known to foul at the surface of carbon electrodes where they form non-conductive polymers that block further neurotransmitter adsorption. For this study, we modify CFMEs with gold nanoparticles to enhance neurochemical testing with fast scan cyclic voltammetry. Au3+ was electrodeposited or dipcoated from a colloidal solution onto the surface of CFMEs. Since gold is a stable and relatively inert metal, it is an ideal electrode material for analytical measurements of neurochemicals. Gold nanoparticle modified (AuNP-CFMEs) had a stability to dopamine response for over 4 h. Moreover, AuNP-CFMEs exhibit an increased sensitivity (higher peak oxidative current of the cyclic voltammograms) and faster electron transfer kinetics (lower &#916;EP or peak separation) than bare unmodified CFMEs. The development of AuNP-CFMEs provides the creation of novel electrochemical sensors for detecting fast changes in dopamine concentration and other neurochemicals at lower limits of detection. This work has vast applications for the enhancement of neurochemical measurements. The generation of gold nanoparticle modified CFMEs will be vitally important for the development of novel electrode sensors to detect neurotransmitters in vivo in rodent and other models to study neurochemical effects of drug abuse, depression, stroke, ischemia, and other behavioral and disease states.

In this study, we modify carbon-fiber microelectrodes with gold nanoparticles to enhance the sensitivity of neurotransmitter detection.

גולד ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות לגילוי משופר נוירוכימי

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

Chemistry

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

ניתוח הכנת photoacoustic של כלי רכב ניידים המכילים Nanorods הזהב

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Bioengineering

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These cell-silicon hybrids offer leadless optical modulation capabilities with minimal perturbation to normal cell behavior. The optical capabilities are obtained by the photothermal and photoelectric properties of SiNWs. These hybrids can be harvested using standard tissue culture techniques and then applied to different biological scenarios. We demonstrate here how these hybrids can be used to study the electrical coupling of cardiac cells and compare how myofibroblasts couple to one another or to cardiomyocytes. This process can be accomplished without special equipment beyond a fluorescent microscope with coupled laser line. Also shown is the use of a custom-built MATLAB routine that allows the quantification of calcium propagation within and between the different cells in the culture. Myofibroblasts are shown to have a slower electrical response than that of cardiomyocytes. Moreover, the myofibroblast intercellular propagation shows slightly slower, though comparable velocities to their intracellular velocities, suggesting passive propagation through gap junctions or nanotubes. This technique is highly adaptable and can be easily applied to other cellular arenas, for in vitro as well as in vivo or ex vivo investigations.

This protocol describes the use of silicon nanowires for intracellular optical bio-modulation of cell in a simple and easy to perform method. The technique is highly adaptable to diverse cell types and can be used for in vitro as well as in vivo applications.

זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video