המחברים מבקשים להודות NanoVentures אוסטרליה לתמיכה במימון הנסיעות ופרופ &#39;ג&#39;ון כובע על שארח באופן חלקי מחקר זה באוניברסיטת שפילד והגב&#39; Jaimee Mayne על עזרתה בזמן הצילומים.

1. Au NRS הכנה הערה: יכול להיות מסונתז Au NRS על ידי מספר המתכונים 16, או שנרכש מיצרנים מסחריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הצפיפות הראשונית האופטית (OD) של פתרון Au NR באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis, על ידי הקלטת ערכי הקליטה מ -300 ננומטר עד 1,000 ננומטר עם רזולוציה של 0.5-2 ננומטר. משתנה הנפח של הפתרון לשימוש עם קובט הזמינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הריכוז הראשוני NP טוחנת עם הטכניקה מתאימה 17 (ספקטרוסקופיה למשל UV-Vis, ספקטרומטריית מסת פלזמה בשילוב אינדוקטיבי חלקיק יחיד, מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים) או להשתמש בערכי הריכוז הניתנים על ידי הספק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 5 מיליליטר ידי דילול מדגם Au NR הראשוני להגיע OD = 1. לדירות הטובות ביותר, לשמור קבוע OD לכל הדגימות שנבדקו. עקוב הפרוטוקול של הספק המסחרי להרכב הממס המדלל. אם אינך בטוח, להשתמש במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מיליליטר של פתרון Au NR פעמיים במשך 15 דקות ב7,800 XG כדי להסיר כל עודף כימי מהפתרון. מחזורי צנטריפוגה יכולים להשתנות בכוח והזמן (למשל g × 20 דקות ב 5,600) 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatants מחדש להשעות NRS במים ללא יונים. כחלקיקים מחדש מושעה עלולים ליצור אגרגטים בפתרון, להכין אותם מדי יום כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר. לחלופין, חנות במקרר לא יותר משבוע 1. לא להקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש בתנאי תרבית תאים, sonicate פתרון Au NR למשך 5 דקות ולאחר מכן לחטא עם אור UV למשך 30 דקות (עוצמת קרינת UV לא פחות מ -400 mW ∙ m -2 ב 254 ננומטר). </li></ol> תרבות קו 2. NG108-15 תאים עצביים ובידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדיום תרבית תאים, להכין 500 מיליליטר של המדיום של Dulbecco סטרילי שונה נשר (DMEM) המכיל 10% (w / v) בסרום עגל עוברי (FCS), 1% (w / v) L- גלוטמין, 1%(W / v) (w / v) ב amphotericin פניצילין / סטרפטומיצין ו -0.5% יכולים להיות aliquoted תוספי, מאוחסנים ב -20 ° C והוסיפו לתקשורת ביום נדרש: הערה. מדיום תרבות תא יכול להיות בקירור במצב סטרילי לתקופה מקסימלית של 1 חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבינוני התמיינות תאים, להכין 50 מיליליטר של DMEM סטרילי המכיל 1% (w / v) L- גלוטמין, 1% (w / v) (w / v) ב amphotericin פניצילין / סטרפטומיצין ו -0.5% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול NG108-15 תאים עצביים ב 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים בצלוחיות T75 עשויים קלקר באינקובטור עם אווירת humidified (5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס). בדרך כלל, זרע 1.5-2 × 10 5 תאים בבקבוק אחד כדי להיות מוכן ב3-4 ימים. שנה בינוני תרבית תאים בכל יומיים. הערה: כדי למנוע סחף או וריאציה גנטיים, לא משתמש בתאים מבוגרים יותר ממעבר 21 לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ומחוברות 70-80% בתרבות, לשנות בינוניות עם בינוני תרבות תא חם וטריה. מכאני לנתק את התאים על ידי בעדינות knocהמלך התחתון של הבקבוק ומחוברות. אל תשתמש בטריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 5 דקות ב 600 XG מחדש להשעות את התא גלולה ב 2 מיליליטר של מדיום התמיינות תאים חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 × 10 4 תאים / סנטימטר זרע 2 בצלחת גם קלקר תרבית רקמת 96 עם 200 μl של מדיום התמיינות תאים. דגירה הניסוי ליום 1 בשעה 5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בין 3.2 × 10 9 -4.2 × 1 0 10 / חלקיקי מיליליטר של תמיסת Au NR ביום 2 ודגירה אותו למשך 24 שעות נוספות. אל תוסיף את החלקיקים לניסויי שליטה. הערה: כפי ששליטה חלופית, Au צירופים ועם אורך גל קליטת שיא היטב הבדיל יכולים לשמש למטרות השוואה 14. להתנהגות תא עקבית יותר, לשמור על צפיפות תאים קבועים ולא לשנות את פני השטח היטב לפני זריעת תאים. </li></ol> 3. neurite תולדה שיפור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוגהלייזר עם סיב אופטי מצב יחיד (צמצם המספרי = 0.13) ולסיים אותו עם מחבר סיבים (המחברים FC נוחים וזמינים בדרך כלל). מדוד את כוח לייזר פלט עם מד כוח סטנדרטי. כדי להשיג את התוצאות האפקטיביות ביותר, להתאים את אורך הגל לשיא של הלייזר לשיא תהודת plasmon של NRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 הדגירה NR הבאה, לתקן את מחבר FC לטוב. מכשיר את דגימות ובקרות בRT דקות 1 בגל רציף, לסמכויות לייזר שונות. לאפשר לתרבות כדי להמשיך במשך 3 ימים נוספים בבית 5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. חזור על הקרנת הלייזר למינימום של 3 מדידות עצמאיות. הערה: זמני הקרנה שונים ותדרי דופק ניתן לבחור, בהתאם ליישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את הלייזר במונחים של קוטר האלומה וirradiance לייזר (W ∙ סנטימטרים -2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיבי מצב יחידים סטנדרטיים, להשתמש = n ∙ θ חטא NA,כאשר n הוא מקדמת השבירה של המדיום בשימוש וθ הוא זווית המחצית מחרוט אור יציאה מהסיבים (ראה איור 1 א). מטריגונומטריה, r = d θ ∙ שיזוף, שבו r הוא רדיוס הקורה וd הוא המרחק בין הסיבים והמדגם. מחבר FC תואם את הקוטר של באר, ולכן מאיר את המדגם במרחק d = 2.70 ± 0.20 מ&quot;מ. אור יוצא הסיבים במים (n = 1.33), נותן r = tan (חטא-1 (NA / n)) ∙ ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המשוואה האחרונה, לחשב את רדיוס קרן לייזר, קרן האזור המתאים וirradiance הממוצעת הלייזר (כוח הלייזר מחולק באזור קרן) ביעד (ראה גרף הדוגמא באיור 1). ערכים אלה מייצגים irradiance הממוצעת מעל האזור המואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הטעויות למדידות עם התאוריה הכללית של התפשטות שגיאה. הערה: b המרחקetween מחבר FC והמדגם ניתן למדוד בתצלומיו של ההסדר הניסיוני ולאחר העיבוד של התמונה באמצעות תוכנה מתאימה (למשל ImageJ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, להסיר בינוני התמיינות תאים מהניסויים ולתקן את הדגימות עם 3.7% (v / v) פתרון פורמלדהיד במשך 10 דקות, ולאחר מכן permeabilize התאים עם 0.1% (v / v) טריטון X-100 עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) על הדגימות עבור 60 דקות כדי לחסום את חלבון unreacted אתרי קישור. תווית הדגימות ללילה אנטי-βIII טובולין (5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS בתוספת 1% מBSA) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 90 דקות בחושך עם נוגדנים משני מתאימים (אנטי עכבר נוגדני IgG למשל TRITC-מצומדות) באמצעות ריכוז של .4-2 מיקרוגרם / מיליליטר בBSA 1% ב- PBS. תווית גרעין התא עם DAPI (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר מים דה מיונן ב) במשך 10 דקות. הערה: נטיית נוגדן ומיג ריכוזht להשתנות בהתאם לפרוטוקול החברה. לשטוף דגימות עם PBS פעמיים במשך 5 דקות לאחר כל שלב צביעה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52566/52566fig1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה על ידי epifluorescence או confocal באמצעות לפחות 20 × אובייקטיביים. בחר מיקרוסקופ מסננים בהתאם לנוגדנים משני. בחר מסנן DAPI (λ = 358 nm EX; λ EM = 488 ננומטר) כדי להמחיש את גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התמונות על ידי הערכה: i) האורך המרבי neurite (שיא האורך מקצה neurite לתחילת גוף התא), ii) מספר neurites לכל תא עצבי (לסכם את כל neurites לכל תא) וiii) את אחוז התאים עם neurites (לחלק את המספר הכולל של תאים לבטא βIII טובולין במספר הכולל של תאים בעלי גרעין מוכתם חיובי) 19. </li></ol> 4. בלייזר מושרה ההדמיה 2 + תאיים Ca <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20% (w / v) פתרון מניות של pluronic F-127 על ידי המסת 2 גרם של מומס ב 10 מיליליטר של sulfoxide נטול מים דימתיל (DMSO). מחממים את הפתרון של pluronic F-127 ב 40 מעלות צלזיוס במשך כ -20 דקות כדי להגדיל את המסיסות. להכין אותו מראש אם הם נמצאים בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 הבאים דגירה NR, להכין תמיסת מלח מאוזנת (BSS; 135 מ&quot;מ NaCl, 4.5 מ&quot;מ KCl, 1.5 מ&quot;מ CaCl 2, 0.5 מ&quot;מ MgCl 2, 5.6 גלוקוז מ&quot;מ, ו -10 מ&quot;מ HEPES, pH 7.4) והשלים אותו עם 5 מיקרומטר של Fluo-4 בבוקר ובDMSO 0.1% (w / v) של פתרון pluronic F-127. הערה: פתרון BSS יכול להיות מוכן מראש וקירור לתקופה מקסימלית של 1 חודש. הוסף את התוספים (Fluo-4 בבוקר וpluronic F-127) ביום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני התמיינות תאים ולהחליף אותו עם פתרון BSS בתוספת. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עם מיקרוסקופ confocal הפוך, דגירה התאים במייקרו-שקופית היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס NG108-15 עם Fluo-04:00למשך 30 דקות בחושך ב5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. בעקבות זמן הדגירה, לשטוף דגימות פעמיים עם BSS כדי להסיר כל fluorophore טעון תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג הלייזר עם סיב אופטי במצב בודד, ודבק בקצה תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית. שים לב לקצה וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ אופטי, על מנת להבטיח איכות גבוהה משטח (כלומר הקצה צריך להיות בניצב לציר הסיבים ושטוח על בדיקה מיקרוסקופית). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את כוח לייזר פלט עם מד כוח סטנדרטי. הכנס את סיבי משלוח האור לבעל סיבים אופטיים ולהדביק אותו לmicropositioner. עיין באל בראון ואח. 20 לפרטים נוספים על הכנת סיבים אופטית ומיצוב. זהירות: בצע את הכללים לבטיחות לייזר במהלך המדידה של כוח הלייזר (למשל לא נראים ישירות לתוך קרן לייזר, לחבוש משקפי מגן בטיחות הלייזר במהלך טיפול, מניעת חשיפה לאור תועה למשתמשי מעבדה אחרים) &lt;./ Li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אוסצילוסקופ לליזר הנייד כדי לפקח על האפנון האופטי. השתמש באות בינארי עם תדרים משתנים (0.5-2 הרץ) ואורכי דופק (20-100 אלפיות שני). חבר הלייזר באמצעות אות האפנון כהיגיון טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) קלט למיקרוסקופ, לאחר ההתקנה מוצגת בet al Paviolo. 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים תחת מיקרוסקופ confocal הפוך ולמקם את סיבי משלוח אור 250 ± 50 מיקרומטר מתא המטרה במצב תאורת שידור. במרחק זה, להשתמש במשוואות שהוצגו ב3.3.1 לחשב את רדיוס הקרן ביעד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בליזר ארגון-יון (488 ננומטר) כדי לעורר את צבע AM Fluo-4 הפנים (λ = 494 nm EX; λ EM = 516 ננומטר) וLD המסונכרן לעירור של NRS endocytosed. לבצע ההדמיה בRT של דגימות ובקרה באמצעות לפחות אובייקטיבי 40 × ידי איסוף סריקות בזמן סדרהעם 256 × 256 פיקסלים / רזולוציה מסגרת במצב הלוך ושוב בתדירות של לפחות 4 הרץ. לבצע הקלטה ללא כל עירור LD לזהות כל הפרעה ארגון יון לייזר (רעש בסיס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרקע מנתונים באמצעות משוקלל adaptively אלגוריתמי הריבועים הפחותים נענשו 21. העלילה Ca 2 + וריאציות המושרית כפונקציה של זמן. לנתח את הפסגות חולפות בעוצמת הקרינה באמצעות תוכנה שלאחר עיבוד תמונה על ידי thresholding ברמה שלוש פעמים סטיית התקן של רעש הבסיס (3σ). </li></ol>

<ol>
	<li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stimulation+with+optical+radiation.">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).</li><li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes.">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).</li><li>Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+ion+channels+and+neurons+through+magnetic-field+heating+of+nanoparticles.">Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles.</a> Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).</li><li>Farah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographically+patterned+activation+using+photo-absorber+induced+neural-thermal+stimulation.">Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation.</a> J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).</li><li>Ciofani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+neuronal-like+cells+following+boron+nitride+nanotube-mediated+stimulation.">Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation.</a> ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+by+iron+oxide+nanoparticles.">Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).</li><li>Myroshnychenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+the+optical+response+of+gold+nanoparticles.">Modelling the optical response of gold nanoparticles.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).</li><li>Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+cancer+therapy+and+imaging+based+on+gold+nanorods.">Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).</li><li>Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+mesoporous+silica-encapsulated+gold+nanorods+as+enhanced+light+scattering+probes+for+cancer+cell+imaging.">A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging.</a> Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).</li><li>Paviolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+increase+neuronal+cell+outgrowth.">Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).</li><li>Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+exposure+of+gold+nanorods+can+induce+intracellular+calcium+transients.">Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients.</a> J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).</li><li>Yong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-nanorod-assisted+near-infrared+stimulation+of+primary+auditory+neurons.">Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons.</a> Adv. Healthcare Mater. , (2014).</li><li>Eom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+infrared+neural+stimulation+using+localized+surface+plasmon+resonance+of+gold+nanorods.">Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods.</a> Small. , (2014).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+Synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications.</a> Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+counting:+towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration.">Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li><li>Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+separation+of+gold+nanorods+using+centrifugation.">Shape separation of gold nanorods using centrifugation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).</li><li>Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+site+influences+the+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells+for+schwann-cell+phenotype+and+function.">Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function.</a> Glia. 59 (5), 734-749 (2011).</li><li>Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+for+investigating+the+mechanisms+of+infrared+neural+stimulation.">Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation.</a> JoVE. (77), (2013).</li><li>Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+fluorescence+background+subtraction+from+Raman+spectra.">Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra.</a> J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).</li><li>Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aligned+3D+neuronal-glial+co-culture+model+for+peripheral+nerve+studies.">An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies.</a> Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+gold+nanoparticles+increase+neuronal+excitability+and+aggravate+seizure+activity+in+the+mouse+brain.">Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain.</a> PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).</li><li>Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+extracellular+application+of+gold+nanostars+increases+hippocampal+neuronal+activity.">Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity.</a> J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).</li><li>Ebbesen, C. L., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+laser-induced+heating+in+optical+neuronal+guidance.">Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance.</a> J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).</li><li>Iwanaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location-dependent+photogeneration+of+calcium+waves+in+HeLa+cells.">Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+minimum+temperature+required+for+selective+photothermal+destruction+of+cancer+cells+with+the+use+of+immunotargeted+gold+nanoparticles.">Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles.</a> Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).</li><li>Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+are+taken+up+by+human+cells+but+do+not+cause+acute+cytotoxicity.">Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity.</a> Small. 1 (3), 325-327 (2005).</li><li>Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subacute+and+chronic+toxicity+of+cetyltrimethylammonium+bromide+(CTAB),+a+cationic+surfactant,+in+the+rat.">The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat.</a> Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).</li><li>Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marz&#225;n, L., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanorods:+synthesis,+characterization+and+applications.">Gold nanorods: synthesis, characterization and applications.</a> Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).</li><li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+golden+age:+gold+nanoparticles+for+biomedicine.">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).</li><li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+photothermal+therapy+(PPTT)+using+gold+nanoparticles.">Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles.</a> Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).</li><li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons.">TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).</li><li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent+rearrangement+of+TRPV4+cytosolic+tails+enables+channel+activation+by+physiological+stimuli.">Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), (2012).</li><li>Roggan, A., Friebel, M., D&#246;rschel, K., Hahn, A., M&#252;ller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm.">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=810+nm+wavelength+light:+an+effective+therapy+for+transected+or+contused+rat+spinal+cord.">810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord.</a> Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).</li><li>Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=780+nm+low+power+diode+laser+irradiation+stimulates+proliferation+of+keratinocyte+cultures:+involvement+of+reactive+oxygen+species.">780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species.</a> Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).</li><li>Wong-Riley, M. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+directly+benefits+primary+neurons+functionally+inactivated+by+toxins+-+Role+of+cytochrome+c+oxidase.">Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).</li><li>Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+mitochondrial+compartment+to+the+optical+properties+pf+the+rat+liver:+a+theoretical+and+practical+approach.">Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach.</a> Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

הפרוטוקולים מפורטים במצגת זו מתארים כיצד תרבות, להבדיל ואופטי לעורר תאים עצביים באמצעות בולמים חיצוניים. מאפייני NR (למשל ממדים, צורה, אורך גל תהודת plasmon וכימיה של פני השטח) ופרמטרי גירוי לייזר (כגון אורך גל, אורך הפולס, שיעור החזרה, וכו &#39;) יכולים להיות מגוון ?...

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי החימום החולף הכרוכות בקליטה של אור אינפרא אדום על ידי מים (אורך הגל&gt; 1,400 ננומטר) ניתן להשתמש כדי לגרום לפוטנציאל פעולה ברקמת עצב 1 וארעי סידן תוך תאי בשריר לב 2. השימוש באור אינפרא אדום העלה עניין רב עבור יישומים בתותבות עצביות, בשל הרזולוציה מרחבית עדינה הפוטנציאל, חוסר מגע ישיר עם הרקמות, מזעור של חפצי גירוי, והסרת הצורך לשנות גנטי את התאים לפני הגירוי ( כפי שנדרש בoptogenetics) 1. למרות כל היתרונות הללו, מודלים תרמיים שפותחו לאחרונה הציעו כי רקמת התאים / היעד עשויים להיות מושפעים מהשפעות מצטברות חימום, כאשר אתרי גירוי מרובים ו / או שיעורים גבוה חזרה משמשים 3,4. בתגובה לאתגרים אלה, חוקרים זיהו את הפוטנציאל לשימוש חיצוני absorbers לגירוי עצב לייצר אפקטי חימום מקומיים יותר ברקמה. הואנג et al. הוכיח את העיקרון הזה על ידי שימוש בננו-חלקיקי פרית פאראמגנטי להפעיל מרחוק ערוצי TRPV1 רגיש לטמפרטורה בתאי HEK 293 עם תדר רדיו שדה מגנטי 5. למרות שטכניקה זו עשויה לאפשר לחדירה עמוקה יותר (שדות מגנטיים מגיבים יחסית חלש עם רקמה), התגובות נרשמו רק על פני תקופות של שניות, ולא המשכים אלפית השנייה הנדרשים במכשירי יונית 5. באופן דומה, פרח et al. גירוי חשמלי של תאי עצב בקליפת המוח הראה עכברוש עם מיקרו-חלקיקים שחורים במבחנה. הם הראו דיוק ברמת תא בגירוי באמצעות משכי דופק בסדר הגודל של מאות מייקרו-שני ואנרגיות בטווח של μJ, פוטנציאל המאפשרים לשיעורי חזרה מהירים יותר 6. השימוש בבולמים חיצוניים גם הוחל לגרוםשינויים מורפולוגיים במבחנה. Ciofani et al. הראה עלייה ~ 40% בתולדת תאים עצביים באמצעות צינורות ניטריד בורון פיזואלקטריים נרגשים על ידי אולטרסאונד 7. בדומה לכך, חלקיקי תחמוצת ברזל endocytosed בתאי PC12 כבר דיווח על מנת לשפר את בידול neurite באופן תלוי מינון, בשל הפעלת מולקולות הידבקות תא עם תחמוצת ברזל 8. לאחרונה, העניין בבולמים חיצוניים כדי לסייע גירוי עצבי גם התמקד בשימוש בננו-חלקיקי זהב (NPS Au). יש צירופים וAu היכולת לספוג ביעילות אור הלייזר בשיא plasmonic וכדי להפיג אותו לסביבה בצורה של חום 9. בין כל צורות חלקיקים הזמינות, הקליטה האופטית של ננו זהב (Au NRS) במקום נוח תואמת את החלון הטיפולי של רקמות ביולוגיות (ליד אינפרא אדום - ניר, גל בין 750-1,400 ננומטר) 10. יתר על כן, בהמשךשלוחה של גירוי עצבי, השימוש בAu NRS מספק biocompatibility נוח יחסית ומגוון רחב של אפשרויות functionalization משטח 11. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי השפעה ממריצה על בידול יכולה להיגרם לאחר חשיפת לייזר רציפה של Au NRS בNG108-15 תאים עצביים 12. באופן דומה, הארעיים סידן תוך תאי נרשמו בתאים עצביים תרבית עם Au NRS אחרי הקרנת הלייזר מווסתת עם תדרים ודופק משתנים אורכי 13. שלילת קוטביות קרום תא נרשמה גם לאחר תאורת לייזר NIR של Au NRS בתרבויות עיקריות של נוירונים הגנגליון ספירלה 14. הראשון ביישום vivo עם מוקרן Au NRS הודגם רק לאחרונה. משקיפים ועמיתים לעבודה נחשפו Au NRS בשיא plasmonic ונרשמו עלייה של פי שש במשרעת של פוטנציאל פעולה עצבי מתחם (CNAPs) וירידה של פי שלושה בסף הגירוי בעצבי sciatic חולדה. Enתגובה חל שיפורים יוחסה להשפעות חימום מקומיות כתוצאה מהעירור של שיא plasmonic NR 15. בעבודה הנוכחית, פרוטוקולים לבודקים את ההשפעה של גירוי הלייזר בNG108-15 תאים עצביים תרבית עם NRS Au מפורטים. שיטות אלה מספקות, דרך פשוטה, אך רבת עוצמה כדי להקרין אוכלוסיות תאים במבחנה תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות סטנדרטיים וחומרים. הפרוטוקול מבוסס על דיודות לייזר בשילוב סיבים (LD), המאפשרת הפעלה בטוחה ויישור הדיר. שיטות הקרנת הכנת מדגם ולייזר Au NR ניתן להאריך עוד יותר לצורות שונות של חלקיקים ותרביות תאים עצביים, ובלבד שפרוטוקולי הסינתזה והתרבות הספציפיים ידועים, בהתאמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Au NR</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>716812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG108-15</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8811230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BDH</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P6867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrometer</td>
			<td>Varian Medical Systems Inc.</td>
			<td>Cary 50 Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Mini Spin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic bath</td>
			<td>Unisonics Australia</td>
			<td>FPX 10D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Hera Cell 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotofix 32A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser diode</td>
			<td>Optotech</td>
			<td>780 nm single mode fibre - coupled LD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>780 HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Laser Check</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>ImageX-press 5000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-slide well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy Ltd.</td>
			<td>LSM 510 meta-confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gold nanorod-assisted optical stimulation of neuronal cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

על ידי שימוש בפרוטוקולים 1, 2, ו -3 שתוארו כאן, השפעה ממריצה על בידול נצפתה בNG108-15 תאים עצביים תרבותיים עם הצירופים וAu (NRS Au, פולי (styrenesulfonate) -coated Au NRS והמצופה סיליקה Au NRS) לאחר לייזר חשיפות בין 1.25 ו -7.5 W · סנטימטר -2. תמונות Confocal של NRS Au כותרת rhodamineB הראו כי החלקיקים הופנמו מ...

Watch this Scientific Journal Video about Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells at JoVE.com

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

gold-nanorod-assisted-optical-stimulation-of-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Swinburne University of Technology. This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Video: Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

שילוב של גירוי מגנטי fMRI Transcranial ולבחון את רשת מצב ברירת מחדל

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: שימוש בפרוטוקול תטא-Burst לחקור Mechasnism של פלסטיות של אנשים עם תסמונת X שביר אוטיזם ו

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

התקן TMS NeuroStar: ניהול ה-FDA פרוטוקול מאושר לטיפול דיכאון

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...