שחרור מלכודות חוץ תאיות על ידי נויטרופילים ותאי חיסון אחרים חשוב בחסינות המולדת אך גם קשור מאוד עם פתולוגיות דלקתיות. מעט מאוד ידוע על תהליך זה מקרופאגים למרות תאים אלה ממלאים תפקיד קריטי בתגובה דלקתית. פרוטוקול זה מספק מודל ראשוני במבחנה אנושית של מקרופאגים מלכודת חוץ-תאית או שחרור תורן.
הוא מספק לנו מודל לחקור צמיחה פיזיולוגית פוטנציאלית של מבנה זה ב vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי התאים מפרוטוקול זה הם תאים ראשוניים מבודדים מן ההכנות מעיל באפי אנושי. אין צורך בשלב priming כדי להבדיל את המונוציטים למאקרופגים, בניגוד לקו תא מונוציטים אחר כגון קו תא THP-1.
פרוטוקול זה מותאם בקלות לתאי חיסון אחרים, כולל נויטרופילים ומיקרוגליה מבודדים. מלכודת חוץ-תאית המיוצרת על ידי מקרופאגים היא שברירית מאוד, ולכן יש לנקוט באמצע הצעד כדי לשמר את שלמות המלכודות המוכתמות. בתנאים סטריליים, להכין M1 priming בינוני על ידי הוספת המדיה המלאה RPMI-1640 תרבות, אינטרפרון גמא לריכוז של 20 ננוגרם למיליליטר ו lipopolysaccharide לריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר.
הכן M2 priming מדיה על ידי הוספת interleukin 4 לתקשורת התרבות המלאה RPMI-1640 לריכוז של 20 ננוגרם למיליליטר. בתנאים סטריליים, שאפו מדיה מ בארות צלחת רקמות זרעים ותרבותיים המכילים HMDM. בזהירות להוסיף לתוך כל באר, מיליליטר אחד של PBS סטרילי מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
הסר את מאגר PBS ושטף פעמיים נוספות. הוסף מיליליטר אחד של המדיה M1 או M2 לכל באר המכילה את HMDM. להחרים את התאים במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5%פחמן דו חמצני באינקובטור תאים.
בתנאים סטריליים, הכינו את אמצעי התקשורת התרבותיים המכילים ממריצים שונים של מהדורת MET למדיית RPMI-1640 המלאה. לניסויים עם גירוי חומצה hypochlorous, להכין 200 חומצה hypochlorous micromolar בצינור פלקון עם HBSS כי כבר התחמם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. לאחר טיפול הקיטוב, שאפו את מדיית התא מכל באר ושטפו בזהירות את התאים שלוש פעמים בעזרת אליקוטים מיליליטריים של PBS סטרילי עבור PMA, אלפא TNF וגירוי אינטרלוקין 8 או HBSS לגירוי חומצה היפוכלורית.
לאחר הסרת ה- PBS בשלב הכביסה הסופי, הוסף מיליליטר אחד של מדיה מלאה המכילה PMA, TNF אלפא או אינטרלוקין 8. הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באינקובטור תא במשך שש שעות עבור גירוי אלפא TNF ו 24 שעות עבור PMA או interleukin 8 גירוי. לניסויים עם חומצה היפוכלורית, לאחר הסרת HBSS בשלב הכביסה הסופי, להוסיף מיליליטר אחד של חומצה hypochlorous מוכן טרי.
ואז להחרים את התאים במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5%פחמן דו חמצני באינקובטור תא. לאחר מכן, שאפו בזהירות את על-טבעי התאים ושטפו את התאים שלוש פעמים בעזרת אליקוטים מיליליטריים של HBSS. לאחר הסרת HBSS מהשבב האחרון לשטוף, להוסיף מיליליטר אחד של מדיה מלאה RPMI-1640 תרבות.
ואז להחרים את התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% פחמן דו חמצני באינקובטור תאים. הכן צבע ירוק SYTOX ב- HBSS בריכוז של 40 מיקרומולרים. מוסיפים ישירות 25 מיקרוליטרים של הצבע לכל באר המכילה HMDM.
דגירה תאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך. לאחר מכן מניחים את HMDM בארות תרבות הרקמות על שלב המיקרוסקופ של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך להדמיה. הפעל מקור אור פלואורסצנטי רחב ספקטרום רחב, מקור אור בהיר ומיקרוסקופ הפוך המותקן במצלמה דיגיטלית צבעונית ברזולוציה גבוהה.
סובב את גלגל המסנן למיקום מספר 2 עבור פלואורסצנטיות ירוקה עם העירור ב 504 ננומטר וממד ב 523 ננומטר. באמצעות המטרה 5X, למקד את התמונה עם המוקד גס ואז ידיות המיקוד בסדר על המיקרוסקופ עד התמונה מופיע חדה, ברורה, וממוקדת. העבר את המיקרוסקופ למצב מצלמה.
הפעל את התוכנה המשויכת. לחצו על הלחצן 'הפעל' כדי להציג את התמונה בתצוגה מקדימה ולהתאים את ידית המיקוד העדינה במיקרוסקופ עד שהתמונה תופיע חדה, ברורה וממוקדת בחלון התצוגה המקדימה של התוכנה. לחץ על לחצן לכידה.
בתוך התוכנה, לחץ על קובץ. שמור כסוג קובץ התמונה הנדרש. במיקרוסקופ, סובב את גלגל המסנן למיקום מספר חמש עבור דימות שדה בהיר וחזור על הליכי הלכידה כדי להשיג את תמונת השדה הבהיר המתאימה.
תמונות שדה בהיר המציגות את השינויים המורפולוגיים של HMDM בתגובה לגירויים מוצגות כאן. מקרופאגים מקוטבים M1 מניסויים עם HMDM שנחשפו לגמא אינטרפרון וליפופולסכריד הראו צורת תא מוארכת דמוית ציר. לשם השוואה, המורפולוגיה של מקרופאגים מקוטבים M2 לאחר החשיפה של HMDM כדי interleukin 4 במשך 48 שעות היו בדרך כלל עגול ושטוח.
היכולת של פנוטיפים HMDM מובחנים לשחרר METs הודמיה על ידי הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים עם ירוק SYTOX. השליטה המתקבלת מכל פנוטיפ HMDM דגירה במשך 24 שעות בהיעדר כל גירויים פרו דלקתיים הראו כתמים ירוקים מוגבלים מאוד. כתמים חיוביים עבור METs, המוצגים כפסים ירוקים, הושגו עם חשיפה של M1-HMDMs לחומצה היפוכלורית, PMA, אינטרלוקין 8 או TNF אלפא.
נוכחות של כמה כתמים ירוקים ניכר בתאים משקף אובדן שלמות קרום אשר עלול לנבוע מוות של תאים כי הוא עצמאי של שחרור מלכודת חוץ תאית. הניסויים שבוצעו עם M2-HMDMs שנחשפו אינטרלוקין 4 הראו שום שחרור של DNA מהתאים, כפי שצוין על ידי היעדר גדילים או פסים של DNA חוץ תאי. עם זאת, הייתה ספיגה תאית מסוימת של צבע פלואורסצנטי ירוק עם החומצה ההיפוכלורית ואלפא TNF.
חשוב להימנע מאור בהיר ישיר אשר יכול לחשיפת יתר של הכתמים לפני הדמיה. דנ"א חוץ-תאי ניתן לכמת על ידי ניתוח qPCR על דנ"א גרעיני ומיטוכונדריאלי נוכח בתא על טבעי. אפיון נוסף של מבנה התורן ותפקידיו בדלקת כרונית באמצעות HMDM עשויים להיות רלוונטיים יותר מבחינה קלינית בהשוואה לחנויות מקרופאגים אחרות של קו תאים מונצחים.
