מתודולוגיה זו מאפשרת לנו לכמת את הפעילות הכימותרפית של מונוציטים בדם בבעלי חיים וללמוד את ההשפעה של תזונה לקויה על תפקוד מונוציטים ועל המנגנונים הבסיסיים שלהם. ניתן לבודד ולנתח מקרופאגים המונוציטים באמצעות גישות שונות, כולל תא יחיד, וטכניקות omics המספקות תמונת מצב של בריאות אתר המונוציטים בדם במודלים של עכברים. ההליך של היום ינוהל על ידי ד"ר יאנג ג'ו אן פרופסור במעבדה שלי, וד"ר Luxi וואנג, פוסט-דוק במעבדה שלי.
לפני תחילת ההליך, לנקות את מכסה המנוע של תאים עם חיטוי לחלוטין להפשיר את פקטורי גדילה מופחתת ממברנה ממברנה פתרון נגזר על קרח. לצייד מזרקים בודדים סטריליים מיליליטר אחד עם 26 מחטי מד ולה מניחים את המחטים על קרח. לאחר שהפתרון מופשר, יש לנגב את החלק העליון של בקבוקון הפתרון שמקורו בממברנה במרתף עם ספוגית אלכוהול לפני טעינת 500 מיקרו ליטרים של פתרון בתוספת או בלי כימותרפיה מושכת לתוך כל מזרק מיליליטר אחד.
לאחר מכן הסר את כל בועות האוויר מהמזרק טעון תמיסת קרום המרתף כדי להבטיח היווצרות תקע אחיד. לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן, לאט להזריק נפח שלם של פתרון שמקורו קרום מרתף ללא MCP-1 הוסיף בערך 100 מיקרו ליטר לשנייה תת עורית לתוך האגף הימני של העכבר הרדמה. וכל 500 המיקרו ליטרים של תכולה שמקורה בממברנה במרתף בתוספת MCP-1 לאגף השמאלי של החיה.
החזק את המזרק במקום 20 עד 30 שניות לאחר ההזרקה כדי למנוע דליפה של הפתרון ולאפשר תקע ג'ל יחיד וחלק לטופס לפני הנחת העכבר על משטח התחממות עם ניטור עד להחלמה מלאה. שלושה ימים לאחר ההזרקה, להסיר את השיער הגבי מבעל חיים תקע מוזרק ולהשתמש מדפים לתפוס את העור סביב החוליה התחתונה החזה המותני העליון. לעשות חתך באורך שני מילימטר לתוך העור לחתוך לאורך קו האמצע של החלק האחורי של העכבר מן החוליות צוואר הרחם עד סנטימטר אחד מעל צומת החוליות coddle.
מפרידים את העור משכבת השריר ומצמידים את העור לפלטפורמת קצף פוליסטירן. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ לנתח, בזהירות לתפוס את הקפסולה סיבי המכיל את תקע ג'ל שמקורו קרום מרתף ולהשתמש מטלפים עדין כדי להסיר את הקפסולה סיבי. לאחר מכן השתמש במספריים עדינים כדי לנקות את התקע.
לאחר מכן להעביר את תקע ג'ל ממברנה מנוקה נגזר לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו שכותרתו כראוי ושקל 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה. לתייג מחדש את הצינור כדי לחשב את המשקל של תקע ג'ל שמקורו קרום מרתף. לעיכול תקע ג'ל שמקורו בממברנה במרתף, השתמשו במספריים עדינים ונקיים כדי לטחון את תקע הג'ל שמקורו בממברנה במרתף בכל צינור מיקרו צנטריפוגה ולהוסיף 800 מיקרו ליטרים של תזוזה לתקעים.
מערבולת במהירות המרבית למשך 10 שניות כדי לשבש את התקעים ולהציב את צינורות המיקרו צנטריפוגה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים במיקסר תרמו ב-1400 סיבובים לדקה כדי להמיס לחלוטין את תקעי הג'ל שמקורם בממברנה במרתף. בסוף הדגירה, משקע את שברי התקע על ידי צנטריפוגה פעמיים ו resuspend כדורי ב 300 microliters של PBS. להעביר 50 microliters של כל מתלה תא לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגה חדשים ולתייג את התאים בצינורות החדשים עם 0.5 microliters של קלצין.
לאחר דגירה של 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו-חמצני, ספרו את מספר הפלואורסצננטים הירוקים החיים בתאים חיוביים ומתים שאינם פלואורסצנטיים על מונה תאים אוטומטי. לניתוח כתם מערבי של תא יחיד, הוסיפו מיליליטר אחד של השעיה מדוללת של תא יחיד לשבב כתם מערבי עם תא יחיד מיובש בתחתית צלחת פטרי באורך 10 ס"מ. לאחר חמש עד 15 דקות, לבדוק את השבב תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
כ-15 עד 20% מהמיקרו בארות צריכות להיות מאוכלסות בתא אחד ופחות משני אחוזים מה בארות צריכות להכיל שני תאים או יותר. אם השבב נטען כראוי, להטות את המנה 45 מעלות ולשטוף את השבב שלוש פעמים עם חיץ השעיה כדי להסיר את כל התאים שלא נקפו. לאחר הכביסה האחרונה, בזהירות לטעון את השבב לתוך תא אלקטרופורזה של מכשיר מערבי תא יחיד, בצד ג'ל למעלה, ולכסות את כל תא יחיד שבב כתם מערבי עם חיץ תזה פועל.
ליזום את תותבת התא ולהפעיל את המכשיר על פי הפרמטרים המתאימים לניסוי. בסוף הריצה, לשטוף את השבב עם שתי שטיפות 10 דקות עם חיץ כביסה טרי לכל לשטוף בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה השנייה, הוסיפו 80 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים העיקרי שמעניין את תא בדיקת הנוגדנים והנמיכו את צד ג'ל השבב כך שתתא הנוגדנים יפתל על פני השבב.
לאחר שעתיים בטמפרטורת החדר, לשטוף את השבב שלוש פעמים חיץ כביסה ופעם אחת במים על שייקר. הדגירה השבב עם נוגדן משני מתאים במשך שעה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את השבב שלוש פעמים עם חיץ כביסה ולסובב את השבב על ספינר שקופית כדי להסיר כל חיץ כביסה שנותר.
כדי להפשיט את שבב כתם המערבי תא יחיד, מניחים מתלה צינור 15 מיליליטר באמבט מים 60 מעלות צלזיוס עם המים רק סנטימטר אחד מעל המדף. במכסה המנוע של האדים, הוסיפו 40 מיליליטר של חוצץ חשפנות ו-320 מיקרוליטרים של אתנול בטא מורפטה למיכל. מניחים את השבב בצלחת פטרי 10 ס"מ בתוך המיכל ולאטום את המיכל עם Parafilm.
ואז למקם את המיכל בתוך מתלה הצינור באמבט המים. לאחר 90 דקות, מעבירים בזהירות את השבב לצלחת פטרי חדשה ושוטפים את השבב פעם אחת עם חיץ שטיפה לפני הוספת 15 מיליליטר של חיץ כביסה טרי לצלחת פטרי לכביסה של 15 דקות על השייקר. בניסוי מייצג זה, התאים שגויסו לכל תקע נספרו באחד, שלושה וחמישה ימים לאחר ההזרקה.
על-ידי חיסור ספירת התאים בתקעים הטעונים ברכב מספירת התאים בתקעים הטעונים MCP-1, חושב אז מספר התאים שגויסו במיוחד בתגובה למשיכת הכימותרפיה. גיוס מואץ MCP-1 ספציפי הצטברות של תאים נצפתה במהלך התקופה של חמישה ימים, עם שיעורים גדל מ 31, 000 תאים ליום לאחר יום אחד של הזרקה עד 136, 000 תאים ליום, חמישה ימים לאחר ההזרקה. ניתוח כתם מערבי של תא יחיד שימש אז לזיהוי סוגי התאים השונים שגויסו לתקעים שמקורם בממברנה במרתף, בהתאם לביטוי שלהם של סמני עניין ספציפיים של תאי החיסון.
לדוגמה, אחוז המונוציטים בתוך תקעי הג'ל הטעונים במרתף MCP-1 היה נמוך ביום הראשון ושיא ביום השלישי לפני שירד שוב ביום החמישי, בעוד שמספר המקרופאז' גדל בהתמדה לאורך כל תקופת המחקר. עבור תקעים טעונים MCP-1, אחוז המונוציטים בתוספת מקרופאגים בתוך אוכלוסיית התאים המבודדים היה הגבוה ביותר ביום השלישי, מה שמצביע על כך שלאחר שלושה ימים, הרוב המכריע של התאים שגויסו על ידי CHEMOTAXIS תלוי MCP-1 היו מונוציטים ומקופאגים. למרות המספר הכולל של מונוציטים בתוספת מקרופאגים הוא בדרך כלל גבוה יותר ביום החמישי לעומת היום השלישי, ספירת התאים ביום השלישי משקף בצורה מדויקת יותר דם היקפי של chemotaxis מונוציטים וגיוס, ולכן היום השלישי מומלץ עבור ניתוחי תקע מרתף ישיר קרום.
רכישה מוצלחת של תאים בודדים לניתוח במורד הזרם תלויה בדיוק ההזרקה ובהסרה מלאה של התקעים. ציטומטריית זרימה, כתם מערבי של תא יחיד, רצף RNA בתפזורת או תא יחיד והליכי omics אחרים יכולים לשמש להערכת המאפיין והפנוטיפים של המונוציטים המגויסים והמאקרופאגים המונוציטים הנגזרים ממונוציטים.
