פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לייעל הן ריכוזי חלבון ונוגדנים ראשוניים בצלחת בדיקה אחת, ולבצע שתי בדיקות באמצעות הכנת מדגם יחיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת 2 1/2 ימים של עבודת מעבדה כולל ניתוח נתונים, להסתיים בתוך 3 1/2 שעות. טכניקה זו מספקת פורמט מבחני תפוקה גבוהה לפיתוח סמן ביולוגי מבוסס דם עבור ALS והיא שיטה אידיאלית לביצוע ניסויים קליניים גדולים.
שיטה זו יכולה לספק תובנה לפרופילי חלבון היעד במהלך פרוגנוזה של המחלה והוא יכול להקל על ניטור ההשפעות של תרופות של ניסויים קליניים מעניינים. לאחר איסוף 100 microliters של lysates טסיות אנושיות של חולי ALS ונושאים בריאים, למלא תבניות שנוצר בבית עבור הפריסה נימי הכנת מדגם. טבלת ההכנה לתערובת לדוגמה היא דינמית ותחשב באופן אוטומטי כמה נפח יש להסיר מהמקור.
שים את כל הראיגנטים על הקרח. מלבד החבילה הסטנדרטית, שאמורה להישאר בטמפרטורת החדר. כדי להכין את תערובת האב הפלואורסצנטי, להוסיף 40 microliters של מים deionized לצינור ברור של DTT, ולהוסיף 20 microliters של מאגר מדגם 10X.
ו-20 מיקרוליטרים של תווי DTT מוכנים של 400 מילימולרים לצינור הוורוד מהתכונה. כדי להכין את הסולם biotinylated, להוסיף 16 microliters של מים deionized, שני microliters של חיץ מדגם 10X ושני microliters של 400 מילימולר מוכן פתרון DTT לצינור הלבן המסופק בערכה. לאחר ערבוב עדין, להעביר את פתרון הסולם לתוך צינור PCR 200 מיקרוליטר לפני denaturing.
הוסף 1.5 מיקרוליטר של חיץ מדגם 10X ו 148.5 microliters של מים deionized לצינור מיקרוצנטריפוגה 600 microliter ומערבולת לערבב, לפני הנחת הצינור על קרח. מוסיפים את הנוגדנים המעניינים ישירות את הדילואנט כפי שצוין בטבלה ושטפו את קצה הפיפס מספר פעמים בתת פתרון נוגדנים הומוגני. כדי להכין את תערובת מדגם נימי, לפתוח את כל צינורות PCR ולהוסיף 1.6 aliquots microliter של מאגר מדגם 5X פלואורסצנטי לכל צינור כפי שצוין בטבלה באמצעות טכניקת צינור הפוכה.
סוגר מיד כל צינור עם הוספת המאגר. כאשר כל המאגר נוסף, פתח את כל הצינורות והוסף מאגר מדגם 0.1X באמצעי אחסון כפי שמצוין בטבלה, מיד סוגר כל צינור בעת הוספת המאגר. לאחר מכן, לפתוח את כל הצינורות ולהוסיף את דגימות החלבון כפי שצוין בטבלה מיד לסגור כל כובע צינור.
כאשר כל הדגימות נוספו, בקצרה צנטריפוגה כל הצינורות בצנטריפוגה ספסל. מערבולת לערבב צנטריפוגה הדגימות שוב. בסוף הצנטריפוגה השנייה, מניחים את כל הצינורות לתוך תרמוסיקלר עם מכסה מחומם.
ולתפור את הדגימות בתנאים שצוינו. בסוף denaturation, צנטריפוגה, לערבב צנטריפוגה הדגימות שוב למקם את כל הצינורות במתלה צינור על קרח. באמצעות הדמות כמדריך, להוסיף 10 microliters של חזרת סטרפטוודין peroxidase גם D1, 10 microliters של הנוגדן המשני המתאים בארות D2 עד D5, 10 microliters של דילואנט נוגדנים לכל באר בשורה B וגם C1, 10 microliters של הנוגדן העיקרי המתאים בארות C2 עד C25, חמישה microliters של סולם biotinylated מצינור PCR מספר אחד גם A1 שלושה מיקרוליטרים של מדגם לשורות A2 עד A25 ו 15 microliters של חמצן luminol מוכן טרי לכל באר של שורה E.Pipetting תערובת המדגם ואת reagent לתוך הבאר הזעירה בסדרים הנכונים הוא קריטי להצלחת הניסוי, ולכן זה צריך להיעשות בזהירות רבה.
לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה לכל מאגר כביסה ייעודי היטב. ולסובב את תכולת הצלחת על ידי צנטריפוגה. כדי לבצע את הניתוח נימי על צלחת בדיקה, לחבר את מנתח נימי למערכת המקוונת ולחץ על מכשיר להתחבר בתוכנת המנתח.
בחרו במספר הסידורי של הכלי בתפריט הנפתח ולחצו על 'התחבר'. בחר את הכרטיסיה Assay ובחר הצגה חדשה, הזן את הפרמטרים של ההתנסויות ושמור את שם הקובץ ואת המיקום. לאחר מכן ודא כי המחוון הכחול המהבהב במנתח הוא כחול מלא ולהסיר את מחסנית נימי מאריזתו.
מוציאים את החותם המגן מצלחת ההתבונןות החזותית בארות מלאות מראש עבור בועות אוויר. מניחים את לוחית ההצבה במחזיק הצלחת ומחזיקים את מחסנית הנימים בזווית, מכניסים את המחסנית לחריץ נימי וסגרו את דלת המנתח. לאחר מכן לחץ על התחל בתוכנת המנתח.
השימוש בתערובת ליזאט טסיות שלם בבדיקות עשוי להפחית את עוצמת האות של חלבוני היעד ולתרום לאות רקע גבוה. לכן, בהסטה זו, על טבעי ברור שימש לאחר קרע טסיות הדם. טווח דינמי ליניארי לריכוז חלבון ציטוסול טסיות הדם נקבע על 0.2 עד 0.8 מיליגרם למיליליטר, ותבנית חיבור אומצה כך שגם ריכוז החלבון וגם טיטרציה הנוגדן העיקרית הצליחו להתבצע בהקשה אחת.
פרופיל זיהוי הטווח הדינמי הגבוה מספק טווח דינמי רחב משמעותית בשל הרגישות הרבה יותר של בדיקת נימי, וכתוצאה מכך זיהוי וכמות טובים יותר על פני טווח ריכוז מדגם גדול יותר. ניתן גם להגדיר זמני חשיפה אישיים. באמצעות תנאי הבדיקות האופטימיים, ניתוח זה של שברים ציטוסוליים lysate טסיות הדם המתקבלים לחולי ALS באמצעות שתי קבוצות של נוגדנים מאפשרים זיהוי של TDP-43 ספציפי למחלה ונגזרת הזרחן שלה בתוך הדגימות.
לאחר מכן ניתן לכמת את ה- TDP-43 הכולל באמצעות עקומת הכיול. והמגוון הבין-מנוהל נבדקו בשברים ציטוסוליים של טסיות הדם האנושיות של ALS. שיטה זו מאפשרת שימוש בנוגדנים ראשוניים, ומאפשרת זיהוי של עד חמישה חלבוני מטרה שונים בתוך אותה דגימה בהקלה אחת.
לא רק שטכניקה זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן ניתוח החלבון, היא דורשת נפחי דגימת מיקרוליטר ומייצרת תוצאות עם רמה גבוהה של רבייה. חלק מהכימיקלים המשמשים בהכאה זו וכל הדגימות האנושיות נחשבים biohazardous, ולכן ציוד מגן אישי מתאים תמיד יש להשתמש בעת ביצוע ניסויים אלה.
