פרוטוקול זה מאפשר לנו לענות על מגוון שאלות על האופן שבו ההגיה פועלת על תאים בפתרון ומספק שליטה משמעותית על משך ההגיה ועוצמתה. שלא כמו טכניקות אחרות, אשר לזהות את ההשפעה של גזירה על תאים משותקים, טכניקה זו מאפשרת לנו להחיל גזירה על תאים בתסרון ומשאיל את עצמו לספקטרום של שיטות זיהוי אותות במורד הזרם. לאחר קבלת דם היקפי מתורם מבוגר מסכים ובריא בצינור 4.5 מיליליטר של 3.8% טריסודיום ציטראט, צנטריפוגה הדם כדי להשיג פלזמה עשירה טסיות דם, ולהשתמש טיפ פיפטה לחתוך בזווית של 45 מעלות כדי להסיר בזהירות את החלק העליון, מעונן, שכבת פלזמה צהובה עשירה טסיות.
להשיג את ספירת טסיות הדם באמצעות ספירת דם מלאה, ולהתאים את ספירת טסיות הדם כ 2.5 פעמים 10 כדי טסיות הדם החמישית למיקרוליטר עם טסיות אנושיות בריכה פלזמה עניים. לאחר מכן, מניחים את ההשעיה על 22 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. לטיפול ליגנד, לאט להוסיף את הנוגדן או ligand של עניין פלזמה עשיר טסיות, ומערבבים את טסיות הדם בעדינות.
במהלך הדגירה, הפעל את מד הקרביים של לוחית הקונוס, והגדר את טמפרטורת הלוח ל -22 מעלות צלזיוס. לאחר חמש עד 10 דקות, מעבירים את הפלזמה העשירה בטסיות דם מטופלות אל מד הקרביים של צלחת הקונוסים הנשלטת בטמפרטורה ישירות במרכז הצלחת, תוך טיפול כך שכל הדגימה מופקדת בין הקונוס לצלחת בנקודת המגע. כדי להחיל גזלה על המדגם, לחשב את ההלקיה על פי מדריך viscometer, ולהחיל גזלה על המדגם בקצב ובמשך המתאים.
בסוף היישום, להרים את הקונוס על שני מילימטרים מהצלחת, כך המדגם נשאר במגע עם הלוח והן את הקונוס, ולהשתמש קצה צינור טעינת ג'ל כדי לאסוף חמישה עד 10 microliters ממרכז נפח המדגם. לאחר מכן להדגיר את המדגם גזירה עם נוגדנים נגד סמני פני השטח של עניין במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולתקן את הדגימות ב 2% paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לנתח את הדגימות לפי ציטומטריית זרימה, לאסוף לפחות 20,000 אירועים עבור כל מצב, ולכומת את עוצמת האות של כל סמן פלואורסצנטי, באמצעות ערך הגובה עבור עוצמת כל פלואורופור.
לאחר מכן השתמש בשליטה שלילית עם אלבומין סרום בקר או רכב כדי לצייר שער, למעט אירועי פלואורסצנט רקע שליליים, ולכומת את אחוז האירועים בתוך השער עבור כל תנאי הניסוי. ביטוי סמן הפעלת טסיות דם בתגובה ליישום כוח ההטיה אינו מוסדר באופן תלוי זמן. כאן, קריאה ייצוגית של הפעלת טסיות דם אנושיות בנוכחות שני נוגדנים המכוונים לתחום N-terminal של גליקופרוטאין 1b-IX ונוגדן בקרה אחד בתנאים גזירה וסטטיים מוצגים.
הביטוי של כל שלושת סמני ההפעלה הוגדל באופן משמעותי בנוכחות כוחות גזיר ונוגדנים ממוקדים, בהשוואה לתנאים סטטיים או בנוכחות נוגדני בקרה. יש לציין, טיפול בנוגדן עם כוח לא מחייב נמוך מדי כדי להפעיל הפעלת גליקופרוטאין 1b-IX אינו מפעיל סמן הפעלת טסיות דם upregulation תחת תנאים כוח סטטי או גזה. כמו כן, פלזמה מחולי תרומבוציטופניה חיסונית המכילה נוגדנים נגד גליקופרוטאין 1b-IX מפעילה תגובות תלויות גזה בניגוד לפלזמה מחולים ללא גליקופרוטאין 1b-IX מיקוד נוגדנים.
בנוסף לניתוחים flowcytometric, תאים שנחשפו גימה יכול גם להיות lysed עבור כתם מערבי, ELISA, וניתוח מפרט מסה כדי לקבוע את כל השינויים ברמת החלבון. כמו תמיד, בעת שימוש בדם או דגימות אנושיות, הקפד ללבוש ציוד מגן תקין ופעל בהתאם לבטיחות המעבדה והנחיות פתוגן שנולדו בדם של המוסד שלך.
