הגדלת הראיות מרמזת על ההשפעה של איתות אסטרוגן על החלק המעי הגס של הפיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה מבטיחה לזיהוי קולטני אסטרוגן במעי הגס והם מתפתחים קוליטיס. אנו מציגים פרוטוקול מלא מאומת עבור הדמיה אימונוהיסטוכימית של קולטני אסטרוגן במעי הגס, באמצעות immunofluorescence. יחד עם ד"ר סילביה מיכלווסקה מהמעבדה להדמיה מיקרוסקופית של אוניברסיטת לודז', נדגים את ההליך.
מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי. חותכים את המעי הגס לרסיס אחד עד שני סנטימטרים. מניחים כל שבר על ספוג בקלטת היסטולוגית המסומנות כראוי.
מקם קלטת המכילה שבר נקודתיים ב- 4%paraformaldehyde. דגירה לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. הכן ותכנת את מעבד הרקמה לשעה אחת של דגירה ב- 50%70%90%95%ו- 100%אתנול, קסילן 100% אתנול וקצילן בלבד, וכן למשך שלוש שעות לפחות של דגירה בפרפין נוזלי.
העבר את שבר המעי הגס לקופסה היסטולוגית. מקם את התיבה במעבד הרקמות המתוכנת מראש והפעל את המעבד. לאחר הדגירה במעבד הרקמות מוציאים את המעי הגס מהתיבה ההיסטולוגית וממקם את שבר המעי הגס בתבנית מתכת, כך ששני קצות המעי הגס נמצאים במצב זקוף.
ממלאים שליש מהתבנית בפרפין נוזלי. מניחים את התבנית באזור הקירור במינוס חמש מעלות צלזיוס לכמה שניות ולאחר מכן להעביר את התבנית לאזור ההתחממות ב 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מניחים את התבנית בחלק התחתון של התיבה ההיסטולוגית ומכסים את כל שבר המעי הגס בפרפין נוזלי.
מניחים את תבנית המתכת המכילה את שבר המעי הגס ופרפין באזור הקירור במשך כמה דקות. לאחר מכן להסיר את עובש המתכת מן המעי הגס ואת בלוק פרפין. דגירה קולון וגוש פרפין לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, להסיר פרפין עודף מהבלוק. הכנס את המעי הגס וגוש הפרפין למיקרוטום סיבובי אוטומטי לחלוטין. חותכים את שבר המעי הגס לחמישה מקטעי מיקרומטר.
מעבירים חלק מעי גס אחד לאמבט מים, שחומם מראש ל-40 מעלות צלזיוס. השתמש במגלשת הזכוכית המסוויגת כדי להסיר את קטע המעי הגס מהאמבטיה ולהדגר את מגלשת הזכוכית בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. ראשית, להסיר את הפרפין על ידי דגירה שקופית הזכוכית ב xylene במשך חמש דקות.
חזור על שלב זה שלוש פעמים. לאחר מכן מניחים את החלקת הזכוכית בתערובת של אחד לאחד של קסילן ו 100% אתנול במשך חמש דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
השתמש בסדרה של ריכוזי אתנול יורדים כדי rehydrate סעיף המעי הגס. לטבול את השקופית באתנול במשך חמש דקות. יש לחזור שלוש פעמים על כל ריכוז לפני שתמשיך לריכוז הבא.
יש לשטוף את מגלשת הזכוכית מתחת למים זורמים למשך חמש דקות. מחממים את מאגר אחזור האנטיגן ל-95 עד 98 מעלות צלזיוס. ואז לחמם את החלקת הזכוכית בתסכול אחזור אנטיגן רותח במשך 10 דקות.
כדי למנוע בזבוז של רייגנטים, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב החלק המעי הגס. לאחר מכן, הדגירה את המגלשה במשך 10 דקות בתווית 3%של מימן peroxidase ומים. לשטוף את השקופית בתסתר כביסה במשך חמש דקות.
לאחר מכן הדגירה את השקופית בתת פתרון חסימה במשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון החסימה והוסף 20 עד 50 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני נגד אלפא E-R, E-R בטא או G-P-E-R מדולל. דגירה הנוגדן העיקרי לילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
הסר את פתרון הנוגדנים. לשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, מוסיפים נוגדן משני מדולל.
הדגירה את המגלשה עם נוגדן משני גדומה צבע במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את פתרון הנוגדנים המשני מהמגלשה. לשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם.
מוסיפים פלואורוכרום מדולל להדמיית קרום ומדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את הפתרון ולשטוף את השקופית שלוש פעמים בתסתר כביסה במשך חמש דקות בכל פעם. הוסף כמה טיפות של DAPI נוזלי מבוסס גליצרול, פלואורוכרום עבור הדמיה גרעיני התא, ישירות על החלק המעי הגס.
כסו אותו בזהירות באמצעות שקופית כיסוי. דגירה סעיף המעי הגס לפחות 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. נתח את קטע המעי הגס תחת מיקרוסקופ קונפוקל הכולל מטרות 20x או 63x וטבילת שמן.
הספציפיות של הנוגדנים המשמשים במחקר אומתה באמצעות תאי MCF-7. נוגדני קולטן האסטרוגן אפשרו זיהוי של קולטני אסטרוגן גרעיניים E-R אלפא ו- E-R בטא, כמו גם קולטן אסטרוגן כרוך קרום G-P-E-R. כמו כן בוצעה שליטה שלילית שבה תאי MCF-7 הוכתמו רק בנוגדנים משניים עם פלואורוכרום ונוזל מבוסס גליצרול עם DAPI.
אות ציטופלסמי חזק של אלפא E-R נמצא בחלקי המעי הגס המתקבל מעכברי בקרה ומעכברים עם מחלת קרוהן הנגרמת על ידי TNBS. עם זאת, רק המעי הגס המתקבל מעכברי בקרה היה E-R אלפא מקומי בציטופלסמה תא הזבל. מיקרוסקופ קונפוקל חשף גם לוקליזציה ציטופלסמית של בטא E-R בחלקי המעי הגס של שני הבקרה והעכברים שטופלו ב- TNBS.
באופן דומה, לוקליזציה ציטופלסמית של G-P-E-R תועדה בחלקי המעי הגס שהתקבלו מעכברי בקרה ועכברים שטופלו ב- TNBS. המיקום הנכון של המעי הגס בתבנית חיוני ליצירת חתך רוחב נכון. פלואורוכרום צריך להיבחר על ידי ספקטרום גירוש ו הפליטה משלו.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על חלבונים אחרים שעשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס. זיהוי אימונוהיסטוכימיה על ידי שפעת חיסונית ניתן להאריך כדי להכתים חלבונים אחרים במצב כיוון חלבון חלבון.
