חשיפה ללחץ עלולה לגרום לצבירה של חלבונים ולגרום לשינויים משמעותיים בהתנהגות הפנוטיפית של חיידקים. ההליך המתואר בסרטון זה מאפשר מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול מתח. בניגוד לנהלים אחרים שפורסמו, פרוטוקול זה דורש מספרי תאים נמוכים יותר ונמנע מתהליכי שיבוש פיזיים מסובכים, כמו גם צעדי כביסה ודגורה הגוזלים זמן רב.
פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר צבירת חלבונים במגוון רחב של חיידקים גרם שלילי ו גרם חיובי. אתה יכול גם לנתח את ההשפעה של מחיקות גנים או להשוות את היעילות של תרכובות פרוטאוטוקסיות. התחל על ידי חנק מושבה אחת של זן E.coli MG1655 ו זן E.coli אורופתיגני CFT073, כל אחד לחמישה מיליליטרים של ציר ליזוגניה, או LB, בינוני.
לדגור על שתי תרביות המרק ב 37 מעלות צלזיוס ו 300 סל"ד במשך 14 עד 16 שעות. לדלל כל זן לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר, או OD600, של 0.1 לתוך בקבוק 500 מיליליטר המכיל 70 מיליליטר של MOPS-g בינוני. לדגור את הבקבוקונים ב 37 מעלות ו 300 סל"ד עד לשלב אמצע היומן הוא הגיע.
לאחר הדגירה, מעבירים 20 מיליליטר של כל תרבות לשלושה צלוחיות 125 מיליליטר מחוממות מראש, ודגר אותם ב-37 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד לשתי דקות. הכן פתרון תרכובת מיקרוביאלית של שני מיליגרם למיליליטר במדיום MOPS-g. הוסף פתרון זה לכל תרבות כדי להגיע לריכוזים הרצויים, והוסף את הנפח הנדרש של מדיום MOPS-g עבור השליטה הלא מטופלת.
לקבוע את OD600 של כל תרבות לאחר 45 דקות של טיפול בלחץ. עבור כל מדגם, aliquot ארבעה מיליליטר של תרבות עם OD600 של אחד לתוך צינורות צנטריפוגות 15 מיליליטר. resuspend כדורי התא ב 50 microliters של חוצץ תמיסת קר כקרח.
לדגור על הדגימות במשך 30 דקות על קרח. הוסיפו לדגימות 360 מיקרוליטרים של חוצץ קר כקרח A, וערבבו בעדינות על-ידי צנרת. העבר את הדגימות לתוך שני מיליליטר צינורות microcentrifuge עם סביב 200 microliters של חרוזי זכוכית 0.5 מ"מ.
לדגור על הצינורות במשך 30 דקות בשמונה מעלות צלזיוס בתרמומיקסר עם רועד ב 1400 סל"ד. לדגור את הצינורות על הקרח במשך חמש דקות בלי לרעוד כדי ליישב את חרוזי הזכוכית. לאחר מכן להעביר 200 microliters של התא ליסייט לתוך צינורות microcentrifuge 1.7 מיליליטר.
צנטריפוגות התא lysate במשך 20 דקות ב 16, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant, אשר ישמש דגימת חלבון מסיס מאוחר יותר. השתמש פיפטה כדי resuspend הכדור ב 200 microliters של חוצץ קר כקרח A.Centrifuge של הצינורות ב 16, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
ואז בזהירות להסיר את supernatant לגמרי. השתמש פיפטה כדי בזהירות resuspend הכדור ב 200 microliters של חוצץ קר כקרח B.Centrifuge הצינורות שוב, ולהסיר בזהירות את supernatant. לאחר מכן לחזור על לשטוף עם חוצץ A.Resuspend הכדור ב 100 microliters של 1x הפחתת SDS חוצץ מדגם, ולהרתיח אותו במשך חמש דקות ThermoMixer ב 95 מעלות צלזיוס.
מערבבים נפח אחד של 100% TCA עם ארבעה כרכים של דגימת החלבון המסיס שנאספו קודם לכן, ודגר במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס למכשכי חלבון. צנטריפוגה הדגימה ב 21, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להשיג את המשקעים, ולהסיר את supernatant. השתמש 200 microliters של אצטון קר כקרח לשטוף את הכדור, כדי להסיר פסולת הסלולר.
צנטריפוגה המדגם שוב כדי להשיג את המשקעים, ולהסיר את supernatant. כדי להסיר את האצטון הנותר מן הכדורים, לשמור על צינורות microcentrifuge ב ThermoMixer ב 37 מעלות צלזיוס עם המכסים שלהם פתוחים. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של 1x הפחתת SDS חוצץ כדי להמיס לחלוטין את הכדור, ולהרתיח את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
מיד לטעון את המדגם על ג'ל polyacrylamide SDS להפרדה, או לאחסן את המדגם במינוס 20 מעלות צלזיוס להמשיך מאוחר יותר. הכן שני ג'לים מפרידים כמתואר בכתב היד של הטקסט. יוצקים את הג'ל בין לוחות הזכוכית באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, ומבטיחים ששני הסנטימטרים העליונים יהיו חופשיים מהתערובת.
מוסיפים 70% אתנול על גבי הג'ל המפריד, ויוצרים ממשק אחיד בין שתי השכבות. לאחר הג'לים המפרידים יש פולימר, להכין את ג'ל הערימה באמצעות הוראות בכתב היד הטקסט. לאחר מכן להסיר את האתנול מן הג'לים המפרידים, ולהוסיף את פתרון ג'ל לערום.
בזהירות להכניס מסרק עם מספר הכיסים הרצוי מבלי להציג בועות אוויר, ולאפשר ג'ל פילמור במשך 20 עד 30 דקות. טען ארבעה מיקרוליטרים של כל דגימה, כמו גם סולם החלבון, לבארות נפרדות. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב חוצץ ריצה טריז גליצין ב 144 וולט במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
השתמש בפתרון פיירבנקס מחומם מראש A כדי להכתים את הג'לים על רוקר במשך 30 דקות ופתרון פיירבנקס מחמם מראש D כדי לדכא את הצבע של הג'לים על רוקר עד שהרקע הרצוי מושג. עלייה נצפתה בכמות צבירה של חלבון שנוצר כאשר תאים טופלו עם 175 מיקרוגרם למיליליטר ו 200 מיקרוגרם למיליליטר של מיקרוביאלית, בהשוואה לתאים לא מטופלים. העלייה בשבר החלבון המסיס הייתה בולטת יותר בזן MG1655 הרגיש יותר.
נצפתה ירידה בכמות החלבונים המסיסים כאשר תאים טופלו עם 175 מיקרוגרם למיליליטר ו 200 מיקרוגרם למיליליטר של מיקרוביאלית, בהשוואה לתאים לא מטופלים. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי נורמליזציה לצפיפות האופטית ב 600 ננומטר חשוב להשוואה של היקף צבירת החלבון בדגימות.
