פרוטוקול זה מדגים הפרדת מקרופאגים לבביים חדשים והשתלה לעכברים בוגרים, אשר עשויה להיות דרך מתירנית לקדם תיקון לב. ההשלכות של טכניקה זו ניתן להרחיב לשדה התחדשות הלב. התחל על ידי קירור מראש פלטפורמת ההפעלה ברונזה לילה ב 20 מעלות צלזיוס.
תוציא את העכבר המרידים מהמקפיא ושים אותו על הרציף. עגן את העכבר בתנוחה על-סופית באמצעות סרט הדבקה רפואי. שים את פלטפורמת ההפעלה עם העכבר מתחת לסטריאוסקופ, ולחטא את תיבת העכבר באמצעות כרית הכנה ספוג betadine ו 70% אלכוהול.
יש להסית את העור בחתך של סנטימטר אחד באזור הבין-צילוגי הרביעי של חלל החזה, ולהפריד את השרירים הבין-ציליים באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים עד שהלב נגיש. לחלופין לחץ על החזה והבטן בעזרת שני מלקחיים עד הלב הוא חיצוני מתוך החזה ללא כל נזק מכני. הגדר את הצלעות מתחת ומעל החתך הקטן כקיבעון טבעי כדי לשתק את הלב, לאתר את פסגת החדר השמאלי ולחתוך קוטר של מילימטר אחד של רקמת פסגת חדרית באמצעות מספריים iridectomy שלך.
אשר כי חדר הלב השמאלי חשוף ומתחיל נוטף. לחץ בעדינות על הלב בחזרה לחלל החזה באמצעות צמר גפן, תפר את השרירים, הצלעות והעור באמצעות שמונה על ידי אפס תפרים נוטה ולנקות את העכבר ביסודיות לאחר הניתוח. העבר את העכבר מפלטפורמת ההפעלה לשמיכת חימום של 37 מעלות כדי לחמם את הגוף מיד לאחר הניתוח.
אשר אנטיביוזה של העכבר על ידי התבוננות בסימנים של שחזור נשימה ספונטני, שינוי צבע העור חיוור לוורוד ותנועה של גפיים. קח את העכבר המופעל בחזרה לאמא שלו ברגע שהוא התאושש. תתבכו את העכבר המופעל וזה חומרי הקינון של אמא, במידת הצורך.
קציר את הלב של עכבר CX3-CR1-GFP ילודים מורדם יום אחד לאחר כריתה apical ולטבול אותו בצלחת 10 ס"מ עם PBS. חותכים את כלי הדם ואת רקמת החיבור הנותרת הרחק מהחומים. חותכים את התוספתן האוזרי ואת דרכי היציאה מהלב.
לאחר שהלב מפסיק לפעום לחתוך את הלב לחתיכות מילימטר מעוקב אחד עד שניים במאגר תמיסת מלח פוספט באמצעות מספריים מיקרוכירורגיים. מעבירים אותם לצינור המכיל 2.5 מיליליטר של תערובת אנזימים מחומם מראש וסוגרים בחוזקה את הצינור. הפוך את הצינור והנח אותו עם הכובע למטה, ואז להפעיל את תוכנית דיסוציאציה לב יילודים.
נתק את הצינור מהדיסוציאטור לאחר השלמת התוכנית. הוסף 7.5 מיליליטר של DMEM 1x עם 10% FBS לצינור. מסננים ומעבירים את המתלים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.
צנטריפוגה השעיית התא ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. להשעות מחדש את גלולה התא במיליליטר אחד של תמיסת תאי דם ודגור במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 5 עד 10 מיליליטר של חוצץ תמיסת מלח פוספט להשעיה וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות.
להשעות מחדש את גלולה התא במיליליטר אחד של DMEM עם 10%FBS, ולאחר מכן למיין מקרופאגים לב ילודים חיובי GFP בפקס. מיין מקרופאגים לתוך צינור סטרילי המכיל 500 מיליליטר של DMEM עם 10% FBS. לספור את מקרופאגים חיוביים GFP ולהשעות אותם מחדש ב- DMEM עם 10% FBS בריכוז של מיליון מקרופאגים לכל 200 מיליליטר של DMEM להזרקה מאוחרת יותר.
מקרופאגים לב ילודים הוזרקו לתוך לב העכבר הבוגר אוטם שריר הלב ויעילות של cardiomyocytes שגשוג אושרה על ידי כתמים אימונופלואורסצנטיים. ניתוח סטטיסטי מראה כי התפשטות קרדיומיוצייט עולה לאחר השתלת מקרופאג '. תמונות אקוקרדיוגרמה מציגות את תפקוד הלב בעכבר מבוגר חודש לאחר אוטם שריר הלב.
תפקוד הלב משופר לאחר השתלת מקרופאג'. מסה בהכתמה מראה כי האזור האוטם בעכבר מבוגר חודש לאחר אוטם שריר הלב צומצם להפליא לאחר השתלת מקרופאג 'לב יילודים. השתלת מקרופאג' לב יילודים עשויה להיות אסטרטגיית קידום לקידום התחדשות לב הפה למבוגרים.
פרוטוקול זה מסייע לחוקרים להמשיך בפיתוח יישומים רגנרטיביים ולחקור את מנגנון התחדשות הלב.
