שיטה ביוכימית זו מאפשרת לקבוע את מצב הפלמיטוילציה של כל חלבון קרום המובע במוח שעבורו זמין נוגדן מתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת טיהור זיקה ובמקום זאת משתמשת בשינויים בניידות הג'ל כדי לקבוע את מספר השינויים של חלבון מעניין. לאחר ניתוח המוח, הומוגניזציה זה מיד 10 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה homogeneizer זכוכית על קרח.
באמצעות כ 12 משיכות, צנטריפוגה lysates במשך 15 דקות ב 1400 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס. העבר את העל-טבעי לצינור חדש על הקרח. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה.
הומוגניזציה זה באמצעות כשש משיכות. צנטריפוגה ההשעיה ב 710 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מערבבים את העל-טבעיים ואת הצנטריפוגות ב-40,000 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את שבר הממברנה המוגלתי במאגר הומוגניזציה על-ידי פירוק גלולה עם קצה פיפטה וצנרת למעלה ולמטה. בצע בדיקת ABCA לכמת את רמות החלבון. כדי לבצע את בדיקת APEGS, מקם 470 מיקרוליטרים של מאגר A בצינור של 1.5 מיליליטר והוסף כ-100 עד 200 מיליגרם חלבון.
Sonicate הצינור ולאחר מכן להפריד את החלבון מסיסים על ידי צנטריפוגה הצינור ב 25 מעלות צלזיוס ומינימום של 13, 000 פעמים G במשך 10 דקות. מעבירים את החלבון המבודד לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. ראשית, לשבש את הקשרים disulphide על ידי דגירה חלבון מסולובל ב 25 microliters של TCEP במשך 60 דקות ב 55 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, לחסום ציסטאינים חינם על ידי דגירה הפתרון עם 12.5 microliters של פתרון המלאי של NEM במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להתחיל את התהליך של משקעים מתנול כלורופורם. מעבירים את ת פתרון החלבון מצינור 1.5 מיליליטר לצינור פוליפרופילן או זכוכית שניתן לצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד במהירות צנועה.
מוסיפים שני מיליליטר של מתנול ומערבולת לזמן קצר. הוסף מיליליטר אחד של כלורופורם ומערבולת בקצרה. לאחר מכן להוסיף 1.5 מיליליטר של מים deionized ומערבולת בקצרה שוב.
במידת הצורך, להפוך את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי. צנטריפוגה הדגימות ב 3000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות רוטור דלי מתנדנד. בזהירות להסיר ולזרוק את השלב העליון של הפתרון בצינור.
הוסף 1.5 מיליליטר של מתנול. מערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך עדין של הצינור, נזהרים לא לפצל את פנקייק החלבון אטום. צנטריפוגה המדגם ב 3000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות רוטור דלי מתנדנד.
באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, להסיר כמה שיותר של השלב העליון של הפתרון ככל האפשר מבלי להפריע פנקייק חלבון. בזהירות לשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של מתנול ולאפשר לו אוויר יבש לפחות 10 דקות. עם משקעים מתנול כלורופורם להשלים, להתחיל את המחשוף של הקישורים thioester palmitoyl על ידי שימוש חוזר את החלבון לזרז 125 microliters של חיץ A.Transfer לצינור חדש 1.5 מיליליטר.
Sonicate הצינור לזמן קצר ולאחר מכן צנטריפוגה זה ב 13, 000 פעמים G ומעלה ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר חומר מסיס. מעבירים את החלבון המבודד לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר ומוסיפים 375 מיקרוליטרים של חיץ H או חיץ T.לאחר הדגירה של הדגימות במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, חזרו על משקעים כלורופורם מתנול. כדי להוסיף m-PEG לציסטאין לא מוגן, התחל על ידי שימוש חוזר את גלולה ב 100 microliters של חיץ A המכיל 10 מיליון או יותר TCEP.
ואז להעביר את ההשעיה לצינור 1.5 מיליליטר. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תוסף M-PEG 5K למלאי וערבבו לפי צינורות. דגירה בטמפרטורת החדר עם סוף על סיבוב סוף.
לאחר 60 דקות של דגירה, להסיר m-PEG 5K מאוגד על ידי ביצוע משקעים מתנול כלורופורם שוב. צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את השלב העליון כמו קודם, הימנעות עבה, פנקייק flocculent.
מוסיפים מיליליטר אחד של מתנול ומערבבים בעדינות אך ביסודיות. צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של מתנול.
שוב, צנטריפוגה מעל 13, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר ייבוש האוויר את גלולה, resuspend אותו 50 microliters של חיץ A ללא TCEP או כל סוכן צמצום. שמור 5 מיקרוליטרים של הפתרון עבור כימות חלבון BCA.
לאחר כימות, להוסיף כמות מתאימה של מאגר מדגם 4x Laemmli. טען את הדגימה לג'ל דף SDS. השתמש בפרוטוקולי העברה וזיהוי סטנדרטיים של הפרדה עבור כתמים מערביים.
כדי לחקור את מצב palmitoylation של חלבוני SynDIG, שברי קרום P2 ממוחות עכבר הומוגניים היו נתונים לבדיקת APEGS. הפרדה ובדיקת נוגדנים הראו כי SynDIG1, SynDIG4 Prrt1, ו Prrt2 הם palmitoylated במוח העכבר. מטרת משקעים מתנול כלורופורם היא למנוע כימיקל אחד, כגון NEM, להפריע לשלב הבא של הפרוטוקול.
משקעים מתנול כלורופורם נאות יסיר כימיקלים לא רצויים תוך מזעור אובדן חלבון. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על lysates המוח מעכברים בגילאים שונים או מאזורי מוח שונים כדי לחקור את התקנות המרחביות-זמניות של palmitoylation.
