ברצוננו להודות למענק דויטשה פורשונגסגמיינשאפט (DFG) BE1911/8-1, לפרויקט LOEWE GLUE, ולמרכז המחקר המשותף תחבורה ותקשורת על פני ממברנות (SFB807) על התמיכה הכספית.

<ol>
	<li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology.">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li><li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins.">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains.">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins.">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li><li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis.">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins.">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li><li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+expression:+no+cells+required.">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li><li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters,+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase.">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype.">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors:+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins.">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li><li>Rues, R. B., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor/nanodisc+complexes+with+different+lipid+environments.">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology.">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li><li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters.">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway.">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li><li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy.">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li><li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems.">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li><li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs.">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li><li>Rues, R. B., Dong, F., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding.">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li><li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., D&#246;tsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer.">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li><li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase.">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li><li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins.">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li><li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems.">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li><li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12.">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li><li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E.+coli+S30+lysate+proteome:+A+prototype+for+cell-free+protein+production.">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li><li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li><li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins.">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4:+Linkages+in+substrate+binding,+spin+state,+uncoupling,+and+product+formation.">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li><li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein.">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs.">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li><li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes:+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities.">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מתוארות ההגדרות והאסטרטגיות למיטוב ביטוי ה- CF והכנסת התרגום המשותף של חברי פרלמנט פונקציונליים לננו-דיסקים. הציוד הנדרש כולל ביוריאקטור, מכשיר עיתונות צרפתי או דומה, קורא UV/VIS ופלואורסצנציה, כלי תגובה CF המתאימים למערך תצורה דו-תאי, ואינקובטור מבוקר טמפרטורה. ציוד סטנדרטי נוסף הוא צנטריפוג...

חלבוני ממברנה (MPs) הם מטרות מאתגרות במחקרי ייצור חלבונים בשל חוסר המסיסות שלהם בסביבות מימיות. פלטפורמות ייצור MP קונבנציונליות מורכבות ממערכות מבוססות תאים כגון E. coli, שמרים או תאים אאוקריוטים. חברי הפרלמנט הרקומביננטיים המסונתזים מופקים מקרום התא או מקופלים מחדש מגופי הכללה1. לאחר סילוק חומרי ניקוי, חברי פרלמנט יכולים להיות מועברים לסביבות ממברנה מתאימות על ידי פרוטוקולים שנקבעו במבחנה מחדש. מלבד שלפוחיות וליפוזומים, שחזור MP לממברנות מישוריות בצורה של חלקיקי ננו-דיסקים2 או סליפרו3 הפכו לטכניקות שגרתיות בתקופה האחרונה. עם זאת, כל האסטרטגיות הללו מרמזות על מגע דטרגנט עם חברי פרלמנט שיכול לגרום לערעור יציבות, דיסוציאציה של אוליגומרים, ואפילו אובדן מבנה החלבוןופעילותו 4. לפיכך, בדיקה לאיתור תנאי סילוק ושיקום אופטימליים של חומרי ניקוי יכולה להיות מייגעת ולגזול זמןרב 5.
האופי הפתוח של מערכות נטולות תאים (CF) מאפשר לתגובת הביטוי להיות מסופקת ישירות עם ממברנות מוכנות מראש עם הרכב שומנים מוגדר. במצב ביטוי מבוסס שומנים זה (L-CF), לחברי הפרלמנט המסונתזים יש הזדמנות להכניס במשותף לתוךה-bilayers 6,7 שסופקו (איור 1). ננו-דיסקים המורכבים מחלבון פיגום ממברנה (MSP) סביב דיסק דו-שכבתי של שומנים מישוריים8 נראים מתאימים במיוחד לאסטרטגיה זו 9,10. ננו-דיסקים יכולים להיות מורכבים באופן שגרתי במבחנה עם מגוון של שומנים שונים, הם יציבים מאוד, ומלאי יכול להיות מרוכז עד 1 mM. עם זאת, ביטוי MSP ב E. coli וטיהור שלה הוא הכרחי. כאסטרטגיה חלופית, MSP יכול לבוא לידי ביטוי יחד עם MP היעד בתגובות CF המסופקות עם ליפוזומים11,12,13. תבניות דנ"א הן עבור MSP והן עבור MP מתווספות לתגובה, ו-MP/nanodiscs יכולים להיווצר עם הביטוי. בעוד שייצור MSP נמנע, אסטרטגיית הביטוי המשותף דורשת כוונון קפדני של ריכוזי תבנית הדנ"א הסופיים וניתן לצפות לשינויים גבוהים יותר ביעילות ייצור הדגימה.
ההחדרה המשותפת של חברי פרלמנט לממברנות של ננו-דיסקים מוכנים מראש היא מנגנון לא פיזיולוגי ועדיין לא ידוע במידה רבה, שאינו תלוי במכונות טרנסלוקון וברצפי אותות13,14,15,16. הגורמים העיקריים המשפיעים על יעילות ההחדרה הם סוג חלבון הממברנה וכן הרכב השומנים של הממברנה המסופקת, עם העדפה תכופה לשומנים טעונים שלילית15,17. מכיוון שהממברנות הננו-דיסקיות מוגבלות יחסית בגודלן, כמות משמעותית של שומנים משתחררת עם הכנסת MP18. וריאציה של גודל ננו-דיסקים מאפשרת החדרה וכוונון של קומפלקסי MP אוליגומריים גבוהיםיותר 15,18. בין היתר, הוצגה הרכבה נכונה של קומפלקסים הומוליגומריים עבור תעלת היונים KcsA, עבור משאבת היונים פרוטאורהודופסין (PR) ועבור הטרנספורטר הרב-דרגי EmrE15,18. חברי פרלמנט צפויים להיכנס לממברנה הננו-דיסקית הסימטרית משני הצדדים בתדר שווה יחסית. לפיכך יש לקחת בחשבון כי מונומרים או אוליגומרים שונים המוחדרים לננו-דיסקית אחת עשויים להיות בעלי כיוונים מנוגדים. עם זאת, הטיה בכיוון יכולה להיגרם על ידי מנגנוני החדרה שיתופיים כפי שדווחו להיווצרות של הקסמרים יחסי ציבור וטטרמרים KcsA18. הטיה נוספת בכיוון MP עשויה לנבוע ממתגי התמצאות של חברי פרלמנט שהוכנסו, ככל הנראה בשפת הממברנות הננו-דיסקיות.
ייצור ליזטים של CF מזני E. coli הוא טכניקה שגרתית אמינה וניתן לבצע אותה כמעט בכל מעבדה ביוכימית19,20. יש לקחת בחשבון כי מלבד היווצרות גשר דיסולפידים, רוב השינויים האחרים שלאחר התרגום נעדרים אם MP מסונתז באמצעות E. coli lysates. בעוד שזה עשוי ליצור דגימות הומוגניות יותר למחקרים מבניים, ייתכן שיהיה צורך לשלול השפעות פוטנציאליות על תפקודן של מטרות MP בודדות. עם זאת, הייצור היעיל של דגימות באיכות גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCR)14,21,22, טרנספורטרים אאוקריוטים 23 או מכלולים הטרומריים גדולים 24 בליזאטים של E. coli CF מצביע על התאמתם אפילו למטרות מורכבות. ניתן לקבל כמויות בקנה מידה מכין (≈ 1 מ"ג/מ"ל) של דגימה עם תצורת שני תאים ללא תאים רציפים (CECF), המורכבת מתערובת תגובה (RM) ותא תערובת הזנה (FM). נפח ה-FM עולה על נפח RM פי 15 עד פי 20 ומספק מאגר של תרכובות אנרגיה בעלות משקל מולקולרי נמוך ומבשרי19. תגובת הביטוי מוארכת אפוא למספר שעות והתפוקה הסופית של יעד ה- MP גדלה. תאי ה-RM וה-FM מופרדים על ידי קרום דיאליזה עם ניתוק של 10-14 kDa. שני התאים דורשים עיצוב מיוחד של מיכל התגובה CECF (איור 1). קלטות דיאליזה מסחריות כמיכלי RM בשילוב עם מיכלי פרספקס מותאמים המחזיקים את ה- FM הם דוגמאות מתאימות. ניתן לתמרן עוד יותר את תשואות MP על ידי שינוי יחסי RM:FM או על ידי החלפת ה- FM לאחר תקופה מסוימת של דגירה.
תפוקה ואיכות של MP דורשות לעתים קרובות אופטימיזציה אינטנסיבית של פרמטרי התגובה. יתרון חשוב של ביטוי CF הוא האפשרות לשנות ולדייק כמעט כל תרכובת בהתאם לדרישות האישיות של חבר פרלמנט. אסטרטגיה פשוטה היא להתמקד תחילה בשיפור התפוקה של MP על ידי יצירת פרוטוקול ייצור בסיסי ולאחר מכן לייעל את איכות MP על ידי כוונון עדין של התגובה ותנאי הקיפול. היעדר תהליכים פיזיולוגיים בליזאטים של CF ומורכבותם המופחתת גורמים לשיעורי הצלחה גבוהים לייצור יעיל של חברי פרלמנט25. שיקולים שגרתיים לתכנון תבנית דנ"א ואופטימיזציה של ריכוז היונים Mg 2+ מספיקים ברוב המקרים כדי להשיג תשואות משביעות רצון26. בהתאם למצב הביטוי, אופטימיזציה של איכות MP יכולה לגזול זמן רב, מכיוון שיש לסנן מגוון גדול יותר של פרמטרים14,17,22.
כדי לבסס את פלטפורמת ביטוי ה-CF המתוארת, פרוטוקולים נחוצים לייצור E . coli CF lysate (i), T7 RNA פולימראז (ii), ננודיסקים (iii) ותרכובות התגובה הבסיסיות של CECF (iv) (איור 1). נגזרות זן E . coli K12 A1927 או BL21 משמשות לעתים קרובות להכנת ליזטים יעילים מסוג S30 (צנטריפוגה ב-30,000 x גרם). מלבד ליזטים מסוג S30, ניתן להשתמש בליזאטים מקבילים הצנטריפוגים בכוחות g אחרים (למשל S12). הליזאטים נבדלים זה מזה ביעילות הביטוי ובמורכבות הפרוטאום. הפרוטאום של ליזאט S30 שהוכן על ידי הפרוטוקול המתואר נחקר בפירוט28. הפרוטאום S30 עדיין מכיל כמה חלבוני ממברנה חיצונית שיורית שיכולים לתת בעיות רקע בעת ביטוי וניתוח של תעלות יונים. עבור מטרות כאלה, מומלץ להשתמש ב- S80-S100 lysates. שינוי רב ערך במהלך הכנת ליזאט הוא אינדוקציה של תגובת SOS על ידי הלם חום משולב ואספקת אתנול בשלב הגדילה באמצע לוג של התאים. הליזטים HS30 המתקבלים מועשרים במלווים וניתן להשתמש בהם בתערובות עם ליזטים S30 לקיפול MPמשופר 22. ביטוי CF בליזאטים של E. coli מופעל כתהליך שעתוק/תרגום מצומד עם תבניות דנ"א המכילות מקדמים הנשלטים על ידי T7 RNA פולימראז (T7RNAP). האנזים יכול להיות מיוצר ביעילות בתאי כוכב BL21(DE3) הנושאים את פלסמיד pAR121929.
שני עותקים של MSP1E3D1 מורכבים לננו-דיסק אחד בקוטר של 10-12 ננומטר, אך הפרוטוקול המתואר להלן עשוי לעבוד גם עבור נגזרות MSP אחרות. עם זאת, ננו-דיסקים גדולים יותר מאלה שנוצרו עם MSP1E3D1 נוטים להיות פחות יציבים, בעוד שננו-דיסקים קטנים יותר שנוצרו עם נגזרות MSP כגון MSP1 עשויים שלא להכיל קומפלקסים גדולים יותר של חברי פרלמנט או MP. ניתן להרכיב ננו-דיסקים של MSP1E3D1 במבחנה עם מגוון גדול של שומנים שונים או תערובות שומנים. ננודיסקים מוכנים מראש הם בדרך כלל יציבים במשך > שנה אחת ב -80 מעלות צלזיוס, בעוד היציבות עשויה להשתנות עבור רכיבי שומנים שונים. לצורך סינון השפעות השומנים על קיפול ויציבות של MP, יש צורך להכין מערך מקיף של ננודיסקים המורכבים ממגוון מייצג של תערובות ליפידים/שומנים. השומנים הבאים עשויים לתת בחירה התחלתית טובה: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-פלמיטויל-2-אולאויל-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) ו-1-פלמיטואיל-2-אולאויל-גליצרו-3-פוספוקולין (POPC).
מתואר פרוטוקול להכנת תגובת CECF של 3 מ"ל. שינוי קנה מידה נוסף למעלה או למטה ביחס של 1:1 אפשרי. עבור תצורת CECF הדו-תארית, יש להכין RM המכיל את כל התרכובות ו- FM המכיל רק את התרכובות בעלות המשקל המולקולרי הנמוך. מכשירי דיאליזה מסחריים של 3 מ"ל עם 10-14 kDa MWCO יכולים לשמש כמכולות RM, אשר ממוקמות לאחר מכן במיכלי פרספקס בהתאמה אישית המחזיקים את ה- FM (איור 1D)30. היחס של RM:FM הוא 1:20, ולכן 60 מ"ל של FM צריכים להיות מוכנים ל-3 מ"ל RM. איכות, ריכוז או סוג של מספר רכיבים יכולים להיות קריטיים לתפוקה הסופית ו/או לאיכות של ה-MP המסונתז (טבלה 1). תבניות DNA צריכות להיות מוכנות על פי ההנחיות שפורסמו ואופטימיזציה קודונית של מסגרת הקריאה של היעד יכולה לשפר עוד יותר באופן משמעותי את תפוקת המוצר26. עבור תגובת CECF בקנה מידה הכנה, מתואר פרוטוקול מבוסס לייצור יחסי ציבור. כדי לקבוע פרוטוקולי ביטוי עבור חברי פרלמנט חדשים, בדרך כלל יש צורך לבצע מסכי אופטימיזציה של תרכובות מסוימות (טבלה 1) כדי לשפר את התפוקה והאיכות. עבור יוני Mg2+ , קיים ריכוז אופטימלי ממוקד היטב שלעתים קרובות מראה שונות משמעותית עבור תבניות דנ"א שונות. תרכובות אחרות של תגובת CF, כגון אצוות חדשות של T7RNAP או ליזטים מסוג S30, עשויות לשנות עוד יותר את הריכוז האופטימלי של Mg2+ . לדוגמה, מסך Mg 2+ טיפוסי בטווח של ריכוז14-24 mM ובשלבים של 2 mM מתואר. כל ריכוז מוקרן בכפילויות ובתגובות CECF בקנה מידה אנליטי. כמיכל תגובה של CECF, מיכלי פרספקס Mini-CECF בהתאמה אישית30 המחזיקים את ה-RM משמשים בשילוב עם מיקרו-לוחות סטנדרטיים של 24 בארות המחזיקים את ה-FM (איור 1B). לחלופין, ניתן להשתמש במחסניות דיאליזה מסחריות בשילוב עם מיקרו-לוחות באר בעומק 96 או התקני דיאליזר מסחריים אחרים בתצורות מתאימות (איור 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td><td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td><td>Merck (Germany)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Alprenolol hydrochloride</td><td>Merck (Germany)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&amp;reg;</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Type GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor Type 884 124/1</td><td>B.Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td><td>Schott Duran (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5&#039;-triphosphate disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose monohydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectrum&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Labs Spectra/Por&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td><td>Fisher Scientific (Germany)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid calcium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>French pressure cell disruptor</td><td>SLM; Amico Instruments (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (Germany)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&amp;beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 dialysis units</td><td>Scienova (Germany)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N-2&lt;/em&gt;-Hydroxyethylpiperazine-&lt;em&gt;N&#039;-2&lt;/em&gt;-ethansulfonic acid (HEPES)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylphosphocholine</td><td>Antrace (USA)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone/peptone from caseine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump: ip-12</td><td>Ismatec (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (Finland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Nanodrop</td><td>Peqlab (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&amp;reg;</td><td>Tecan (Switzerland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultra sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&amp;rsquo;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 antifoam</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

מערכות ביטוי ללא תאים מאפשרות תכנון מותאם אישית של סביבות תגובה כדי לתמוך בקיפול פונקציונלי של אפילו חלבונים מורכבים כגון חלבוני ממברנה. ההליכים הניסיוניים להחדרה וקיפול של חלבוני ממברנה לתוך ממברנות מוכנות ומוגדרות המסופקות כננו-דיסקים מודגמים. הפרוטוקול נטול דטרגנטים לחלוטין ויכול לייצר מיליגרם של דגימות מטוהרות תוך יום אחד. דגימות חלבון/ננו-דיסקים של הממברנה המתקבלות יכולות לשמש למגוון מחקרים פונקציונליים ויישומים מבניים כגון התגבשות, תהודה מגנטית גרעינית או מיקרוסקופיית אלקטרונים. מתוארת הכנה של רכיבי מפתח בסיסיים כגון ליזטים ללא תאים, ננודיסקים עם ממברנות מעוצבות, פתרונות מלאי קריטיים וכן הרכבה של תגובות ביטוי דו-תאיות ללא תאים. מאחר שדרישות הקיפול של חלבוני ממברנה יכולות להיות מגוונות ביותר, המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא אפנון של פרמטרים ושלבי תגובה החשובים לאיכות הדגימה כגון תרכובות תגובה בסיסיות קריטיות, הרכב ממברנה של ננו-דיסקים, חמצון-חיזור וסביבת מלווה, או עיצוב תבניות DNA. התהליך כולו מודגם עם סינתזה של פרוטאורהודופסין וקולטן מצומד לחלבון G.

ההשפעה של תרכובות תגובה של כוונון עדין על התפוקה הסופית או האיכות של חברי פרלמנט מסונתזים מודגמת. גישה שגרתית נפוצה היא להתאים את הריכוז האופטימלי של Mg2+ בתגובות CF על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כניטור נוח של יעילות המערכת. לדוגמה, GFP סונתז מווקטור pET-21a(+) בריכוזי Mg 2+ בין 14...

Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

co-translational-insertion-membrane-proteins-into-preformed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.3K Views.  Goethe University Frankfurt. החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

Video: Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a particularly attractive option for studying membrane proteins, especially in the context of ligand-receptor interactions. The method pioneered by Sligar and colleagues is based on the amphipathic properties of an engineered highly a-helical scaffold protein derived from the apolipoprotein A1. The hydrophobic faces of the scaffold protein interact with the fatty acyl side-chains of the lipid bilayer whereas the polar regions face the aqueous environment. Analyses of membrane proteins in nanodiscs have significant advantages over liposome because the particles are small, homogeneous and water-soluble. In addition, biochemical and biophysical methods normally reserved to soluble proteins can be applied, and from either side of the membrane. In this visual protocol, we present a step-by-step reconstitution of a well characterized bacterial ABC transporter, the MalE-MalFGK2 complex. The formation of the disc is a self-assembly process that depends on hydrophobic interactions taking place during the progressive removal of the detergent. We describe the essential steps and we highlight the importance of choosing a correct protein-to-lipid ratio in order to limit the formation of aggregates and larger polydisperse liposome-like particles. Simple quality controls such as gel filtration chromatography, native gel electrophoresis and dynamic light scattering spectroscopy ensure that the discs have been properly reconstituted.

Nanodiscs are small discoid particles that incorporate membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. We provide a visual protocol that shows the step-by-step incorporation of the MalFGK2 transporter into a disc.

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Biology

דפוס חלבון הפיך מבוקר אור על קרומי שומנים

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

מחבר זרקור: צילום גיוס חלבונים הניתנים להחלפה לדפוסים הפיכים במערכות תאיות מלאכותיות

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

Bioengineering

Protein Translocation Machinery on the ER Membrane

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides into the ER lumen and their insertion into the ER membrane.
Sec61 protein conducting channel
In eukaryotes, the translocon complex comprises a core heterotrimeric translocator channel called the Sec61 complex. This channel includes three transmembrane proteins, Sec61&#945;, Sec61&#946;, and Sec61&#947;, and is the largest subunit of the translocon complex. In higher eukaryotes, such as mammals, the channel is capped in its resting state to prevent the leakage of ions like calcium into the cytosol.
Accessory protein complexes associated with the Sec61 channel
Sec62 and Sec63 are integral transmembrane proteins associated with the Sec61 complex. They are primarily involved in the functioning of the Sec61 channel&#39;s lateral gate and aid in the exit of the signal sequence and transmembrane domains into the lipid bilayer.
The translocon-associated protein or TRAP complex is a hetero-tetrameric constitutive subunit of the translocon complex, present behind the Sec61 channel. It assists in the binding of signal peptides having low hydrophobicity to the Sec61 channel. The oligosaccharyltransferase (OST) complex is another closely associated complex, which transfers pre-assembled glycans to select asparagine residues.
Some proteins, like the signal peptidase complex, associate with the translocon complex under specific conditions. For instance, the signal recognition particle receptor (SR) only interacts with the Sec61 channel to hand over the ribosome-nascent peptide complex during active translocation. Other proteins like lectin chaperones (calnexin and malectin) and sensor molecules (IRE1) associate with the translocon to correctly fold the incoming polypeptide or signal misfolded proteins.

מכונות טרנסלוקציה של חלבונים על קרום המיון

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides ...

Education

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

KEY TERMS AND CONCEPTS

Cotranslational Protein Translocation

Translocation of proteins across membranes is an ancient process that occurs even in bacteria and archaebacteria. In fact, the components of the translocation machinery are still conserved between prokaryotes and eukaryotes.
Sec61 channel partners for cotranslational translocation
During cotranslational translocation, the Sec61 channel partners with the signal recognition particle (SRP), the signal recognition particle receptor (SR), and the ribosomes to transport the nascent polypeptide chain into the lumen.
SRP mediates ribosome attachment to the Sec61 complex via the polypeptide exit tunnel of the large ribosomal subunit. The GTPase domains on both SRP and SR carry out GTP hydrolysis, which supports the transfer of the target polypeptide to the Sec61 channel. Subsequently, the ribosomes act as primary translocation motors and push the protein towards the ER lumen. Except for the GTPs spent during peptide chain elongation, no additional energy is expended for the protein to descend through the channel.&#160;
Accessory translocon complex proteins involved in cotranslational translocation
The translocating chain-associating membrane (TRAM) protein and translocon-associated protein (TRAP) complex are auxiliary components associated with the Sec61 channel during SRP-mediated translocation. The TRAP complex is a substrate-specific complex essential for secure anchoring of the signal sequences having low hydrophobicity. Its proteins directly interact with Sec61 and keep the channel in open confirmation to compensate for the weak interaction with the signal sequence.
On the other hand, TRAM is a membrane protein that acts as a chaperone. It assists in folding and membrane integration of cotranslationally translocating proteins.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל

תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל

תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל

מכונות טרנסלוקציה של חלבונים על קרום המיון

טרנסלוקציה של חלבונים קו-תרגומיים