המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר ולטהר Oviduct BDNF בפרוטוקול ממוטב מעורבים transfection של תאי HEK293 וטיהור בעמודת כרומטוגרפיה. Oviduct BDNF הוא אז mono-biotinylated על ידי תגובת חוץ ויתור עבור תיוג אחורי וזיהוי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא מאפשר ייצור, טיהור, מונו-ביוטיניזציה של BDNF באופן אופטימיזציה.
הפרמטרים ההריון כבר אופטימיזציה לייצור BDNF מקסימלי באמצעות reagent transfection חסכוני תהליך הטיהור מבוצעת בהתקנת כרומטוגרפיה המאפשרת מניפולציה ומאפשרת להסלים את ההליך. התחל בדילול 60 מיקרוגרם של פוליאתילנימין ב-500 מיקרוליטרים של DMEM לא ממומש ו-20 מיקרוגרם של פלסמיד BDNF ב-500 מיקרוליטרים של DMEM לא ממומש לכל מנה של 15 ס"מ לנה לחילוף. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בזהירות pipette את פתרון ה-DNA לתוך צינור פוליאתילנימין, ערבוב פעם אחת על ידי תנועה למעלה / למטה.
דגירה במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לטפטף מיליליטר אחד של תערובת PEI / DNA לאורך כל צלחת 15 ס"מ. הדגירה את התאים עם תערובת PEI / DNA במשך שלוש שעות ולאחר מכן לשנות את המדיום למאגר הדגירה. 48 שעות לאחר ההיפוך של התאים, לאסוף את המדיום מכל הכלים.
לאחר מכן הוסיפו את הרכיבים הבינוניים של BDNF לעל-טבעי HEK293 כולל נתרן כלורי, רכיבים במאגר פוספט, אימידזול ומעכבי פרוטאז. דגירה בקרח במשך 15 דקות. ואז עלה על המדיום לתוך צינורות צנטריפוגה.
צנטריפוגה במשך 45 דקות ב 10, 000 גרם בצנטריפוגה זהב ארבע מעלות צלזיוס. שלב זה מאפשר חיסול של פסולת תאים ותאים מתים תלויים בתקשורת. אז תאסוף את העל-טבעיים.
מוסיפים BSA בריכוז סופי של 0.1% ומאחסנים במינוס 20 מעלות צלזיוס עד חודשיים. כדי לטהר את BDNF, להתחיל על ידי הפשרת התקשורת באמבטיה תרמו מוסדר 37 מעלות צלזיוס. ואז תהפוך את התקשורת לצינורות צנטריפוגה.
צנטריפוגה במשך שעה אחת ב 3, 500 גרם בצנטריפוגה זהב ארבע מעלות צלזיוס. שלב זה מאפשר חיסול של פסולת שנותרה כדי להבטיח זרימה נאותה דרך עמודת הכרומטוגרפיה. לאחר מכן השתמשו ברכזי החלבון כדי להפחית את המדיה מ-500 מיליליטר ל-100 מיליליטר.
עקבו אחר פרמטרי הצנטריפוגה המומלצים של היצרן לריכוז אופטימלי. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של חרוזי ניקל-נת"ע לתקשורת המרוכזת ודגירה בין לילה בנדנדה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להרכיב את מנגנון הכרומטוגרפיה ולשפוך את התקשורת לתוכו.
תן לו לנוח במשך חמש דקות ולאחר מכן לפתוח את התרנגום דו-כיוון להפסיק לתת את המדיום לזרום דרך. לשטוף עם חמישה מיליליטר של חיץ לשטוף במשך חמש דקות הקפדה על שימוש חוזר את חרוזים בעמודה. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
לבסוף, הוסף מיליליטר אחד של מאגר אלוטיון לעמודה הקפדה על שימוש חוזר חרוזים. דגירה במשך 15 דקות ולאחר מכן לאסוף את eluent בצינור microcentrifuge. חזור על שלב זה שלוש פעמים עבור אלוט מוחלט של BDNF.
כדי biotinylate BDNF, לקחת aliquot המכיל 800 ננוגרם של החלבון ולהוסיף את חיץ biotinylation reagent ולאחר מכן כמה BirA-GST ביחס טוחן אחד לאחד BDNF. דגירה בתנור הכלאה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, ערבוב התוכן של הצינור כל 15 דקות על ידי היפוך. לאחר מכן להוסיף את אותו נפח של ATP ו BirA-GST כמו בשלב הראשון דגירה במשך 60 דקות, ערבוב התוכן של הצינור כל 15 דקות.
BDNF biotinylated לאחר מכן ניתן להשאיר בקרח לאימות biotinylation מיידית או מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח אחורי. כדי לאמת את הביוטיניזציה של oviduct BDNF, להתחיל על ידי חסימת 30 microliters של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין לכל מדגם BDNF במאגר חסימה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת ולאחר מכן לזרז את חרוזים מגנטיים במפריד ארון מגנטי ולאחר מכן להשליך את חיץ החסימה.
הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר חסימה טרי ואת מדגם BDNF לחרוזים, הקפד לעשות בהם שימוש חוזר לחלוטין. הומוגניזציה של התוכן של הצינור דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בצינור microcentrifuge מסובב. הכן את המדגם עבור כתמים מערביים כמתואר בטקסט כדי להעריך את היעילות של תגובת biotinylation.
כדי להצטייד oviduct BDNF לנקודות קוונטיות, להתחיל על ידי הוספת הנפח הדרוש של נקודות קוונטיות כדי להשיג קשר טוחן אחד לאחד BDNF ולאחר מכן לדלל לנפח סופי של 20 microliters. הומוגניזציה של התוכן של הצינור ולאחר מכן לעטוף אותו בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בנדנדה.
לאחר מכן לדלל את oviduct BDNF לריכוז הסופי הרצוי ולהוסיף אותו לתא האקסונאלי של תא microfluidic, דגירה במשך 210 דקות עבור הדמיה אחורית חיה או קבועה תאים. השימוש בפרוטוקול המבוסס על עמודות כרומטוגרפיה מאפשר עיבוד של אמצעי אחסון משמעותיים של מדיה מותנה HEK293. בניסוי זה, 500 מיליליטר של מדיה מותנה עובדו כדי לטהר Oviduct BDNF.
ארבעה אלוטונים רצופים נמשכו 15 דקות כל אחד הניב ריכוזים יורדים של Oviduct BDNF הנע בין שישה ל 28 ננוגרם למיקרוליטר. התשואה הכוללת הסתכמה בכ-60 מיקרוגרם של Oviduct BDNF. BDNF מטוהר זה היה אז biotinylated על ידי תגובה במבחנה מתווך על ידי BirA-GST.
המדגם היה biotinylated הומוגנית כפי שהודגם על ידי חוסר oviduct BDNF שאינם biotinylated ב supernatant של חיץ נקי חרוז מגנטי. תוצאות אלה מראות כי הפרוטוקול המוצע מאפשר טיהור של כמויות משמעותיות של oviduct BDNF והומוגני במבחנה מונו-ביוטינילציה. ואז הפעילות הביולוגית של BDNF מונו-ביוטינילציה הוערכה באמצעות שתי גישות ניסיוניות שונות.
ראשית, נוירונים קליפת המוח זרעו 60 מילימטר צלחות היו מגורה עם 50 ננוגרם למיליליטר של BDNF מונו-biotinylated במשך 30 דקות ולאחר מכן חלבונים הוכנו לניתוח כתם מערבי. הפעילות הביולוגית של ה-BDNF המונו-ביוטינילציה כומתה על ידי גילוי פוספו-TrkB ופוספו-ERK. קשירה של BDNF ל TrkB מפעילה את הזרחון האוטומטי של הקולטן ואת ההפעלה של כמה קינאזות במורד הזרם כולל ERK.
מצב שליטה שלילי שלא היה מגורה עם BDNF ומצב שליטה חיובי אשר היה מגורה עם BDNF זמין מסחרית נכללו לניתוח של BDNF oviduct פעילות ביולוגית. הלהקות היו שניהם חלבונים זרחניים, היה בעוצמה דומה נוירונים שטופלו BDNF מסחרי מונו ביוטינילציה BDNF, ושניהם הראו אות חזק יותר מאשר מצב שליטה שלילית. לאחר מכן הוערכה הפעילות הביולוגית של BDNF מונו-ביוטינילציה יחד עם נקודות קוונטיות סטרפטבידין כדי להוכיח שניתן להשתמש בהן בניסויי הדמיה חיים.
נוירונים קליפת המוח נזרעו בכיסויים של 10 מילימטר וטופלו בריכוז סופי של 200 נקודות קוונטיות פיקומולריות או שתי נקודות קוונטיות של BDNF ננו-מולאר במשך 30 דקות לפני תיקון וכתמים לפוספו-CREB. CREB הוא גורם שעתוק אשר ממוקד על ידי ERK12 מופעל נוירונים קליפת המוח. גירוי נוירונים עם ריכוזים הולכים וגדלים של נקודות קוונטיות BDNF הביא לעלייה תלוית מינון של זרחון של CREB ונוכחות של חלקיקי נקודה קוונטית המקיפים את הגרעין המציין כי חלקיקי נקודה קוונטית BDNF היו אנדוציטו והפעילו את ההפעלה של מסלולי איתות הקשורים להפעלת TrkB בתיווך BDNF.
עלייה של פי שניים באות פוספו-CREB זוהתה בעת גירוי נוירונים עם 200 נקודות קוונטיות של BDNF פיקומולר, בעוד שגירוי עם שתי נקודות קוונטיות של BDNF ננו-מולאר הביא לעלייה של פי 3.5 באות הפוספו-CREB. לכן, oviduct BDNF biotinylated פעיל ביולוגית והוא לא מאבד את פעילותו כאשר יחד עם נקודות קוונטיות סטרפטבידין מה שהופך אותו מתאים immunofluorescence והדמיה של תאים חיים. לבסוף, פוטנציאל ההדמיה של נקודות קוונטיות BDNF הוערך בתרבויות ממודרות באמצעות תאים מיקרופלואידיים.
נוירונים קליפת המוח נזרעו בתאים מיקרופלואידיים כדי להפריד את התאים האקסונאליים והסומטודנדריטיים ועוררו שתי נקודות קוונטיות של BDNF ננו-מולאר למשך 3.5 שעות. מיקרוסקופיה של תאים חיים בוצעה והקימוגרפים וכתוצאה מכך שימשו לכימות המהירות של נקודה קוונטית BDNF המכילה organelles. זוהתה מהירות נעה ממוצעת של 0.91 מיקרומטר לשנייה, בהתאם לניתוח הקודם של הובלה בתיווך ציטופלסמי.
תאים מיקרופלואידיים שטופלו בשתי נקודות קוונטיות ננו-מואלריות לא הראו נקודות קוונטיות נעות בקבוצות המיקרו כפי שמוצג על ידי הקימוגרף. תאים שגודלו באותם תנאים היו מגורים עם 500 פיקומולר או שתי נקודות קוונטיות BDNF ננו-מולאר במשך 210 דקות ולאחר מכן קבועים ומתויגים בכתם גרעיני. נוירונים שטופלו בנקודות קוונטיות של BDNF מראים הצטברות תלוית מינון של החלבון המסומן בכל תת-התת-חיבורים המנותחים, כולל החלקים הפרוקסימליים והדיסטליים של קבוצת המיקרו והתא הסומטודנדריטי.
לעומת זאת, נוירוני בקרה לא הראו כמעט אות נקודה קוונטית בכל התא. לכן, ניתן לזהות את הנקודה הקוונטית BDNF בתאים חיים וקבועים בתאים מיקרופלואידיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לייצר oviduct BDNF mono-biotinylated בהליך חסכוני מבוסס טור כרומטוגרפיה.
