המחברים רוצים להכיר אוניברסיטת אקרון למימון שתמך בעבודה זו.

יש המחברים אין לחשוף.

הנדסת חלבון רקומביננטי היא טכניקה חזקה מאוד שמשתרעת על פני תחומים רבים. זה חסכוני, מתכונן והליך פשוט יחסית, המאפשר הייצור של תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד. חשוב לציין כי עיצוב ולבטא חלבוני מטרה הוא לא תמיד פשוט. ביטוי בסיסי ויציבות חלבון רקומביננטי תלויה בבחירות ספציפיות של וקטור, E. זני coli תא, שנוספו תג פפטיד ופרמטרי טיפוח. קריטריון העיצוב הספציפי שלנו מנצל א מבוסס היטב coli זנים להנדסת חלבונים. בנוסף, וקטור פלסמיד מכיל אמרגן לאק T7 וגן התנגדות אמפיצילין לביטוי חלבונים רקומביננטיים יציב. לאחר קבלת הפלסמיד subcloned נקי במיוחד, ההליך העיקרי הראשון הוא להפוך בהצלחה את חלבון המטרה לתא המארח ולקבוע את המסיסות שלהחלבון. ביטויי מבחן הם הזמן הטוב ביותר כדי לייעל את הסינתזה של חלבון המטרה. חשוב למרוט מושבות קטנות ומבודדות (איור 2 א), כדי להבטיח בחירה טובה יותר של תאי חיידקים המכילים את הפלסמיד. אסטרטגיות לפתרון בעיות כגון restreaking להפיץ מושבות או דוגרים צלחות אגר לתקופות זמן קצרות יותר יכולים לסייע בתצורות מושבה טובות יותר. אין זה מפתיע שייצור חלבון רקומביננטי גורם ללחץ על מתח המארח 36. בשלב זה, אם הביטוי הוא עני, יכולים להיות מותאמים גורמים כגון אנטיביוטיקה וריכוז IPTG כמו גם זמן אינדוקציה וטמפרטורה על מנת להשיג את יעד החלבון האופטימלי (לביקורות לראות 37-38). זו נראתה לNGF בי הביטוי הטוב ביותר נובע מאינדוקצית הלילה בשעה 18 ˚ C (איור 2E). Sema3A הביא לייצור חלבון לתנאים מקומיים, אלא nonnativבידוד דואר לא הראה ייצור חלבון (איור 3 ב). תרבויות עיקריות של NGF היו מושרה למשך 4 שעות ב 37 ˚ C, כמו גם לינה ב18 ˚ C ומבודד בתנאים מקומיים. טיהור FPLC הפיקה תשואה נמוכה יותר של NGF בהשוואה לתרבויות עיקריות שבודדו nonnatively לאחר אינדוקציה הלילה בשעה 18 ˚ C (איור 3 א). היווצרותם של חלבונים בגופי הכללה היא חשבה בדרך כלל להיות לא רצוי מאז renaturation קשה לפעמים ולא תמיד מצליח. זה הוביל לפיתוח של טכניקות כדי לשפר את מסיסות חלבון כולל התוספת של רצפי חלבון מסיסים 39-41. עם זאת, חלבונים הוכחו להחזיק צורות של מדינות קונפורמציה תוך מבודדים בגופי הכללה, ופרמטרים כגון טמפרטורות אינדוקציה נמוכות לעזור לשמור על מבנים הפעילים אלה 42-46. כאשר חלבון יכול לבוא לידי ביטוי רק בצורה בלתי מסיס זה בדרך כלל ניתן מחדשטבע החלבון לאחר הבידוד תוך שימוש בטכניקות פשוטות עם אובדן תשואה מעט מאוד כפי שדיווחנו בעבר 21. הראנו כיצד להנדס בהצלחה ולייצר חלבוני biotinylatable באמצעות E. מערכת ביטוי כמארח מניב כ 8-10 מ&quot;ג / התרבות העיקרית של 2 ל &#39;זה שיבוט וcoli חשוב לציין כי הרצף הכולל של אירועים נשאר זהה כאשר ייצור חלבונים רקומביננטיים חדשים (איור 1), ואולם, מותאם אישית לכל חלבון שנעשה צריך להיות מטופלים על מקרה להגוף כדי לקבוע כיצד לייצר את התשואה הגבוהה ביותר של מוצר מטוהר באופן ספציפי. הראנו כיצד NGF וSema3A מתנהגים באופן שונה באותה מערכת הטיפוח ואיך לייעל את הייצור שלהם. בנוסף, אנו משתמשים כרגע עוד E. זן מארח coli B שיכול biotinylate in vivo 47 לחלבוני יעד אחרים, הממחיש את החשיבות של ישארגרם היטב הודיע ​​על ההתקדמות המתמשכת ושינויים בנוגע להנדסת חלבונים רקומביננטיים.

חלבונים לכסות טווח רחב של ביומולקולות כי הם אחראים לתפקודים ביולוגיים רבים, סופו של דבר מוביל להיווצרות רקמה תקינה וארגון. מולקולות אלה ליזום אלפי איתות מסלולים השולטים עד ויסות ו / או למטה רגולציה של גנים וחלבונים אחרים, שמירה על שיווי משקל בגוף האדם. שיבוש של חלבון יחיד משפיע על אינטרנט זה שלם של אותות, אשר יכול להוביל להתפרצות של הפרעות או מחלות הרסניות. הנדסת חלבונים בודדים במעבדה מציעה פתרון אחד למאבק בתופעות הלוואי הללו ומציע אלטרנטיבה לתרופות מולקולה קטנות. ב1977, גן מקודד רצף סומטוסטטין חומצת אמין 14 היה אחד מפוליפפטידים הראשונים המהונדסים שנוצרו באמצעות ה coli 1. זמן קצר לאחר מכן בשנת 1979, אינסולין שובט בפלסמיד pBR322, שינה, בא לידי ביטוי, ומטוהר 2. מאז, חלבונים רקומביננטיים הרחיבו את השפעתם לשדות מרובים של מילearch כגון חומרים ביולוגיים, אספקת סמים, הנדסת רקמות, Biopharmaceuticals, חקלאות, אנזימים תעשייתיים, דלק ביולוגי, וכו &#39;(לביקורות לראות אזכור 3-8). זה נובע במידה רבה צדדיות שהטכניקה מציעה באמצעות התוספת של moieties היישום הספציפי הכימי או רצפי חלבונים למטרות כוללים, אך לא מוגבלת, לזיהוי חלבון המטרה, ייצוב וטיהור. באמצעות טכנולוגיית ה-DNA רקומביננטי, יכולים לבוא לידי ביטוי חלבונים רקומביננטיים במגוון רחב של מערכות מארח אוקריוטים פרוקריוטים ובכלל זה, צמח, חרק, שמרים, פטריות, חיידקים או יונקים. כל מארח מציע יתרונות שונים, ובדרך כלל את המערכת הטובה ביותר נקבעה בהתבסס על תפקוד חלבון, תשואה, יציבות, עלות כוללת, ויכולת רחבה. תאי חיידקים לעתים קרובות חסרים את מנגנוני השינוי לאחר translational שמארחי אוקריוטים לספק (כלומר glycosylation, גישור דיסולפיד, דואר<html> TC.) 5. כתוצאה מכך, מערכות של יונקים וחרקים בדרך כלל תוצאה של תאימות טובה יותר וביטוי של חלבוני אוקריוטים, אולם המארחים אלה הם בדרך כלל יקרים יותר ו9 זמן רב. לכן, א &#39; coli הוא המארח המועדף עבור מערכת הביטוי שלנו, כי תאים להתרחב במהירות בתנאי גידול זולים ומנגנוני ביטוי הגנטיים הם הבינו 5,9 כן. בנוסף, מערכת זו היא קלה בקנה מידה, למטרות ייצור ותוצאות בחלבונים תפקודיים למרות העדר לאחר translational השינויים 10. E. זן החיידק K12 נבחר בפרוטוקול זה לשיבוט כי זן זה מציע תשואות פלסמיד מצוינות המבוססות על יעילות שינוי גבוהה. בנוסף, א &#39; זן החיידק BL21 מנוצל לביטוי בגלל מתח מארח זה מכיל את גן RNA פולימראז T7 המספק ביטוי חלבון בשליטה ויציבות 11. אוהל &quot;&gt; לאחר בחירת מארח, טיפול נוסף חייב להילקח בבחירת וקטור הביטוי האידיאלי כדי להקל על ביטוי שנבחר ובשליטת חלבון. סינתזת חלבונים רקומביננטיים מתחילה ברצף ה-DNA יעד כי הוא משובט בניהולו של שעתוק T7 bacteriophage ואותות תרגום, ו ביטוי מושרה בתאי מארח המכילים עותקי כרומוזומליות של גן RNA פולימראז T7 12. וקטורים אלה, הנגזרים מpBR322 וקטור פלסמיד (לסקירה ראתה התייחסות 13), נשלטים בחוזקה על ידי אמרגן T7 פותח לראשונה על ידי בוחן ועמיתים 14 ולספק נוסף שליטה באמצעות הכללתו של המפעיל לאק וזה מדכא לאק (lac1) 15,16. להנדסת חלבונים רקומביננטיים, מערכת ביטוי זה מציעה את היכולת להתאים את רצף חומצות אמינו מסוים של חלבון רצוי על ידי החדרת רצפי DNA יעד שונים או כדי ליצור חלבוני היתוך מורכב מתחום שילובים מחלבונים יחיד. בנוסף, חלק מסדרת הווקטור כוללת שינויי תג פפטיד להיות מושם על N או התחנה הסופית C. למטרות העיצוב שלנו, תג היסטידין (שלו) התווסף לרצף יעד DNA לטיהור ורצף biotinylatable 15 חומצת אמינו נכלל לbiotinylation 17,18. בפרוטוקול זה פלסמיד המכיל גן התנגדות אמפיצילין, נבחר לבצע רצפי חלבון היתוך biotinylatable שלנו. הביטוי נשלט בוקטור זה באמצעות אמרגן T7 לאק ומושרה בקלות עם איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ביטויי מבחן (תרבויות בקנה מידה קטנה) משמשים כדי לקבוע את הנוכחות ומסיסות של חלבון המטרה, שיכול לבוא לידי ביטוי בכל צורה מסיסה או לא מסיס לגבש נהלי טיהור. חלבון מסיס הביע בתוך תא החיידק יעבור קיפול ספונטני כדי לשמור על המבנה המקורי שלו 19. בדרך כלל הילידיםהמבנה הוא חיובי thermodynamically. במקרים רבים את הפעילות המטבולית של המארח היא לא תורמת לחלבון המטרה, שימת דגש על מערכת שמובילה לייצור חלבון מסיס והיווצרותם של גופי הכללה מורכבים מאגרגטים חלבון לא מסיסים. כך חלבון מטרת denatures, טיוח אותם בדרך כלל פעיל מבחינה ביולוגית 20. ביטויי הבדיקה שניהם טיפסו למעלה, ונהלי בידוד נקבעים על ידי המסיסות של חלבון המטרה. Renaturation נוסף או refolding צעד נדרש לחלבונים בלתי מסיסים. חלבונים רקומביננטיים וכתוצאה מכך יכולים להיות מטוהרים נוסף באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל. בבית של ייצור חלבון רקומביננטי מציע יתרונות עלות על מוצרים מסחריים מאז מיליגרם חלבון המטרה של יכול להיות מבודד לליטר של התרבות העיקרית. רוב הציוד הנדרש זמין במעבדה ביולוגית או כימית טיפוסית. הנדסת חלבונים מאפשרת יצירהשל חלבוני היתוך מותאם אישית עם פונקציות הוסיפו שאינן תמיד זמינים באופן מסחרי. איור 1 מתאר את הנהלים העיקריים מעורבים בחלבונים רקומביננטיים הנדסה. עם מערכת ביטוי זה שיצרנו חלבונים רבים biotinylatable, כגון אינטרפרון גמא, נגזר גורם גדילה של טסיות דם, וחלבון עצם morphogenetic 21-23, אך אנו נתמקד בשני חלבונים שמיועדים להדרכה האקסון, NGF (29 kDa ) וSema3A (91 KDA) 10 (לסקירה ראה התייחסות 24). Biotinylation הוא טכניקה נפוצה לזיהוי, חוסר תנועה ובידוד של חלבונים שכותרתו ניצול האינטראקציה ביוטין-streptavidin הידוע 25-27. בדיקות Biophysical 28,29, biosensors 30, ונקודות קוונטיות ביום 31 בכמה דוגמאות של מערכות המנצלות את הזיקה הגבוהה של נטיה ביוטין-streptavidin עם ד K על סדר 10 -15 M 27. E. יו coliהאנזים פח, בירה, מסייע בקובץ המצורף קוולנטיים של ביוטין לשרשרת צד ליזין נמצאת בתוך ביוטין מתויג רצף 18,32. ביוטין קשירה לחומרים וביומולקולות ייצר אספקה ​​מתמשכת של גורמי גדילה של תאים עבור יישומי הנדסת רקמות מרובים 21,33-35. לכן, הנדסת חלבוני biotinylatable המותאם במיוחד אלה היא כלי רב עוצמה שיכול להתעלות מעל אינטרסים מחקר מרובים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

הנדסת חלבונים רקומביננטיים ניצלה חיידקי Escherichia מערכות (E. coli) ביטוי לכמעט 4 עשורים, והיום ה coli הוא עדיין אורגניזם מארח בשימוש נרחב ביותר. הגמישות של המערכת מאפשרת התוספת של moieties כגון תג ביוטין (עבור אינטראקציות streptavidin) וחלבונים תפקודיים גדולים יותר כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק או חלבון אדום דובדבן. כמו כן, השילוב של חומצות אמינו לא טבעיות כמו chelators יון מתכת, קבוצות פונקציונליות ייחודי תגובתי, בדיקות ספקטרוסקופיות, ומולקולות הקניית לאחר translational שינויים אפשר מניפולציה טובה יותר של תכונות חלבון ופונקציונליות. כתוצאה מכך בטכניקה זו יוצרת חלבוני היתוך להתאמה אישית שמציעים כלי משמעותי לתחומי מחקר שונים. באופן ספציפי יותר, רצף חלבון biotinylatable כבר שולב לתוך חלבוני יעד רבים בגלל האינטראקציה זיקה הגבוהה בין ביוטין עם avidin וstreptavidin. תוספת זו סייעה בשיפור זיהוי וטיהור של חלבונים מתויגים, כמו גם לפתוח דרך ליישומים משניים כגון מיון תא. לכן, מולקולות שכותרתו ביוטין להראות השפעה גוברת ונרחבת בתחומים bioindustrial ויו. לצורך המחקר שלנו יש לנו מהונדס חלבוני היתוך biotinylated רקומביננטי המכילים גורם עצב צמיחה (NGF) וsemaphorin3A (Sema3A) אזורים פונקציונליים. יש לנו דיווח בעבר כיצד חלבוני היתוך biotinylated אלה, יחד עם רצפי חלבון פעילים אחרים, יכולים להיות קשורים לחומרים ביולוגיים להנדסת רקמות ומטרות רגנרטיבית. פרוטוקול זה מתאר את היסודות של חלבוני biotinylatable ההנדסה בקנה מידת מיליגרם, ניצול וקטור T7 Lac מושרה וא מארחים coli ביטוי, החלו משינוי בהיקף של למעלה וטיהור.

<html> שיבוט וביטוי מבחן כאשר ציפוי מבוצע כראוי, מושבות מבודדות אחת צריכה טופס כדי להגדיל את הסיכוי של מריטת תאי חיידקים הפכו משובט (איור 2 א). עם זאת, אם יותר מדי תאים הם מצופים, הצלחות מודגרת יותר מדי זמן ב-C ° 37 או שינוי הוא בספק, מושבות עשויות לכסות את הצלחת אגר או ליצור אגרגטים גדולים יותר של תאים (2B דמויות ו2C). במהלך ביטוי בדיקה, NGF וSema3A היו מושרה ראשון במשך 4 שעות ב 37 ° C ו SDS-PAGE הניתוח נקבע שני החלבונים היו ממוקמים בחלק מסיס (איור 2 ד). ביטוי חלבון נראה הוגן ולכן ביטוי מבחן נוסף עם אינדוקציה הלילה בשעה 18 ° C נבדק. NGF הביא לביטוי טוב יותר בחלק הקטן המסיסים, ואילו לא היה הבדל מורגש עם Sema3A (2E איור). &quot;&gt; בידוד, טיהור וBiotinylation NGF וSema3A שניהם היו מבודדים באמצעות טכניקות בידוד יליד כמפורט בפרוטוקול לעיל ולהפעיל דרך עמודת FPLC לטיהור. בנוסף חלבונים רקומביננטיים אלה בודדו וטהרו nonnatively. למרות NGF היה בשבריר מסיס בביטוי בדיקה, נהלי בידוד ילידים מיוצרים תשואה נמוכה של NGF לאחר שני 37 ° C (4.57 מ&quot;ג / התרבות העיקרית של 2 ליטר) ו18 ° C (6.11 מ&quot;ג / התרבות העיקרית של 2 L; איור 3 א, קווים מוצקים זירוזים). עם זאת, תשואה גבוהה יותר של NGF הושגה באמצעות בידוד nonnative עם renaturation (10.72 ± 1.8 מ&quot;ג / תרבות העיקרית של 2 L; איור 3A קו, מקווקו) לאחר 18 ° C, אינדוקציה הלילה. מצד השני, בידוד nonnative לא גרם לייצור Sema3A (איור 3B, קו מקווקו) עם 8.61 ± 3.1 מ&quot;ג / תרבות העיקרית של 2 ליטר לבידוד מקורי (איור 3<html> ב &#39;, קו מוצק). כתוצאה מכך, NGF היה מבודד בתנאי nonnative לאחר אינדוקציה הלילה בשעה 18 מעלות צלזיוס, ואילו, Sema3A עבר בידוד האם לאחר 4 שעות של אינדוקציה ב 37 ° C. פסגות FPLC נאספו, ודגימות NGF וSema3A נותחו עם SDS-PAGE (איור 3). פסגות חלבון נוספות מצאו בפלט FPLC לSema3A (איור 3 ב) נאספו ונותחו עם SDS-PAGE ולא ממוקמות באזור המשקל המולקולרי Sema3A. שברים אלה הם מוצרים פגומים סבירים להניח כי הם לא מתנהגים מבחינה תפקודית במבחני תא המבוסס כפי שעשה שיא Sema3A מצויינים באיור 3. חלבוני biotinylated באמצעות אנזים בירה וdialyzed כדי להסיר כל מיני unreacted. Biotinylation אושר עם ערכת כימות ביוטין וקורא microplate ניאון. &quot;Src =&quot; ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. הנדסת חלבוני ניצול E. מערכת ביטוי coli. התהליך הבסיסי של הנדסת חלבונים רקומביננטיים כרוך בעיצוב של פלסמיד לשכפול ולביטוי בE. coli. מושבות הפכו נבחרות עם השימוש באנטיביוטיקה. ביטויי מבחן קטנים המשמשים כדי לייעל ולזהות את הייצור ומסיסות של חלבון המטרה. הליך זה מוקטן עד cultivations הגדול אצווה (בסולם ליטר). שיטות כרומטוגרפיה משמשות לבודד ולטהר רצוי חלבון המהונדס. שינויים כגון biotinylation יכולים להתרחש במהלך cultivations אצווה או לאחר טיהור. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51295/51295fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51295/51295fig2.jpg" /> איור 2. O<html> ptimizing ביטוי מבחן NGF וSema3A. () ציפוי 25 μl של ע &#39;השתנה תאי coli K12 הביאו במושבות קטנות ומבודדות. מושבה אדם צריכה להיבחר לביטוי מבחן. לתאים BL21 הפך הפצת מושבה דומה צריכה להתרחש. (BC) ציפוי 50 μl ושל תאי K12 100 μl, בהתאמה, הביאו להתפוצצות אוכלוסין של מושבות חיידקים. מריטה מצלחות אלה עלולות לגרום בסבירות נמוכה יותר של בחירת מושבה נגזרה מתא הופך אחד. ביטויי בדיקה (D) של תאים שינו היו מושרה למשך 4 שעות ב C ° 37 עם IPTG, ו- SDS מראה כי חלבון היתוך NGF (29 KDA) וחלבון Sema3A היתוך (91 KDA) באים לידי ביטוי בחלק הקטן מסיס. אינדוקציה הלילה (ה &#39;) ב18 ° C מראה ביטוי NGF עדיין בחלק הקטן המסיסים, עם זאת, הביטוי לSema3A לא משופר. = &quot;תמיד&quot;&gt; בעמודים <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51295/51295fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51295/51295fig3.jpg" /> איור 3. טיהור של NGF וSema3A באמצעות FPLC. בידוד nonnative () לאחר 18 ° אינדוקציה לילה C (קו מקווקו) הביא לתשואות טובות יותר NGF בהשוואה לבידוד מקורי בשתי שעות 4, 37 מעלות צלזיוס ובלילה, זירוזים 18 C ° (קווים מוצקים). (ב) לSema3A, אינדוקציה על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ומצב בידוד האם של תשואות טובות יותר בהשוואה לבידוד nonnative באותו הפרמטרים טיפוח. SDS-PAGE מציג אוספי שיא FPLC (חיצים) עבור שניהם () NGF וSema3A (ב &#39;). סטנדרטי חלבון סינון ג&#39;ל נדרס כדי לאשר את חלוקת המשקל המולקולרית של הפסגות ומצוינות ברקע של חלקות FPLC בkDa. <table fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody&gt; <tr><td> בדידות </td><td> חוצץ </td><td> רכיבים </td></tr><tr><td> Nonnative </td><td> תמוגה / לשטוף </td><td> 6 M GuHCl, 100 מ&quot;מ H 2 4 Napo, 10 מ&quot;מ טריס בסיס, imidazole 10 מ&quot;מ; pH = 8.0 </td></tr><tr><td> Elution </td><td> 6 M GuHCl, 200 מ&quot;מ חומצה אצטית קרחונית (17.4 ז) </td></tr><tr><td> דיאליזה (renaturation) </td><td> חיץ מלוח פוספט (PBS): 21.7 מ&quot;מ אא 2 PO 4, 15.3 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 149 מ&quot;מ NaCl </td></tr><tr><td> הצפת 1: PBS, 0.2 M GuHCl, dithiothreitol מ&quot;מ 1.99 (DTT) ב4 מים ultrapure L; pH = 7.4 </td></tr><tr><td> החיץ 2: PBS ב 4 מים ultrapure L; pH = 7.4 </td></tr><tr><td> ילידים </td><td> תמוגה </td><td> 50 מ&quot;מ אא 2 PO 4, 300 mM NaCl, imidazole 10 מ&quot;מ; pH = 8.0 </td></tr><tr><td> לשטוף </td><td> 50 מ&quot;מאא 2 PO 4, 300 mM NaCl, imidazole 20 מ&quot;מ; pH = 8.0 </td></tr><tr><td> Elution </td><td> 50 מ&quot;מ אא 2 PO 4, 300 mM NaCl, 250 imidazole מ&quot;מ; pH = 8.0 </td></tr><tr><td> דיאליזה </td><td> חיץ מלוח פוספט (PBS): 21.7 מ&quot;מ אא 2 PO 4, 15.3 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 149 מ&quot;מ NaCl </td></tr><tr><td> הצפת 1: PBS, 1.99 מ&quot;מ DTT ב4 מים ultrapure L; pH = 7.4 </td></tr><tr><td> החיץ 2: PBS ב 4 מים ultrapure L; pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. חוצצי בידוד חלבון רקומביננטי.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

יש לפתח חלבוני היתוך biotinylatable יישומים פוטנציאליים רבים בתחומים שונים של מחקר. הנדסת חלבון רקומביננטי היא הליך ישר קדימה כי הוא חסכוני, המספק תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד.

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.4K Views.  University of Akron.  יש לפתח חלבוני היתוך biotinylatable יישומים פוטנציאליים רבים בתחומים שונים של מחקר. הנדסת חלבון רקומביננטי היא הליך ישר קדימה כי הוא חסכוני, המספק תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד. 

Video: Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; להנדסת רקמות עור

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the wet spinning method, gelatin fibers are produced by smooth extrusion in a suitable coagulation medium. To increase the functional surface of these gelatin fibers and their ability to mimic the features of tissues, gelatin can be molded into a tube form by referring to this concept. Examined by in vitro and in vivo tests, the gelatin tubes demonstrate a great potential for application in tissue engineering. Acting as a suitable filling gap material, gelatin tubes can be used to substitute the tissue in the damaged area (e.g., in the nervous or cardiovascular system), as well as to promote regeneration by providing a direct replacement of stem cells and neural circuitry. This protocol provides a detailed procedure for creating a biomaterial based on a natural polymer, and its implementation is expected to greatly benefit the development of correlative natural polymers, which help to realize tissue regeneration strategies.

We developed and describe a protocol based on the wet spinning concept, for the construction of gelatin-based biomaterials used for the application of tissue engineering.

תהליך לכייר רטוב-ספינינג מבוססי ג'לטין על התחדשות רקמות

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...