הפרוטוקול שלנו משמעותי משום שהוא מאפשר לחוקרים העובדים על פטריות שאינן מודל את ההזדמנות להקים טכנולוגיות חדשניות לעריכת גנום במעבדות שלהם. מכיוון שהוא אינו מסתמך על טכניקות קיימות, כגון מערכות ביטוי, לפרוטוקול זה יש את היתרון של להיות קל יותר להקים במערכות שאינן מודלים. שיטה זו יכולה לשמש על פני מיני פטריות שונים והוא יכול לשמש כדי להבהר פונקציות של גנים המעורבים הזדווגות מסלול, צמיחה, פתוגניות.
לכן, בעת ביצוע הליך זה, יש לוודא שיש מספיק ימים רצופים על מנת להתחרות בפרוטוקול שכן יש רק כמה נקודות בניסוי שבו ניתן להשהות אותו. כדי לקצור את הקונידיה, לסנן את התרבות הנוזלית דרך שכבה של בד מעבדה סטרילי לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה. תן מחדש את גלולת הקונידיה בחמישה מיליליטר של מים והצג 10 microliter aliquot של פתרון conidia תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 40X כדי לאשר כי רק conidia כבר התאוששו.
לאחר מכן, מוסיפים 200 מיליליטר של מרק תמצית 1%מאלט טרי לבקבוק 500 מיליליטר ומעבירים את כל נפח הקונידיה לבקבוקון. ואז להדק את התרבות הנוזלית עד 12 שעות ב 25 מעלות צלזיוס רועד אינקובטור ב 120 מהפכות לדקה. כדי לקצור את germlings, להעביר את התרבות 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר עבור צנטריפוגה resuspend את germlings עד 10 מיליליטר של סורביטול טוחנת אחת.
מוסיפים מיליליטר אחד של תותחת חיידקים לריכוזים שונים של תות אנזימים וגוררים את תספורת אנזים הנבגים במשך שעתיים עד שלוש שעות באינקובטור הרועד ב-80 מהפכות בדקה. כדי לקצור את protoplasts, לסנן את פתרון האנזים דרך שכבה של בד מעבדה סטרילי ולאסוף את protoplasts על ידי צנטריפוגה. ואז בזהירות resuspend גלולת protoplast ב 200 microliters של חיץ STC ולבדוק aliquot 10 microliter של הפתרון תחת מיקרוסקופ כדי לאשר כי רק protoplasts נמצאו.
כדי להתחיל את הטרנספורמציה, לשלב כחמש פעמים 10 לשישה protoplasts עם נפח אחד של פתרון ריבונוקלאופרוטאין וכ -6 מיקרוגרם של שבר ה- DNA התורם. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי לטפטף מיליליטר אחד של פתרון PTC טרי שהוכן טרי על המתלה של הפרוטופלסט כדי ליצור שכבה הידרופובית מעל הפרוטופלסטים ולטגר את הפתרון במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום שליטה osmotic כדי ההשעיה protoplast, צינורות לאט ובעדינות כדי לערבב ביסודיות את הפתרון.
לאחר ערבוב, להנהר את הפתרון protoplast באינקובטור רועד ב 80 מהפכות לדקה לילה. למחרת בבוקר, לחלק את הפתרון בין חמש צלחות תרבות 60 מילימטר. הוסף 10 מיליליטר של אגר בינוני שליטה אוסמוטית בתוספת 30 מיקרוגרם למיליליטר של Hygromycin B לכל צלחת לאט לסובב כל צלחת לערבב.
אפשר לשכבה הראשונה של אגר להגדיר לפני הוספת 10 מיליליטר של אגר בינוני שליטה אוסמוטית בתוספת 40 מיקרוגרם למיליליטר של Hygromycin B שתיים כל צלחת. לאחר מתן אפשרות לשכבה השנייה של אגר לקבוע, הדגירה את התרבויות ב 25 מעלות צלזיוס עד מבודד יחיד ניתן לראות גדל דרך שתי שכבות של אגר. כדי לשחזר את המבודדים שעברו טרנספורמציה מוצלחת, להעביר את המבודדים המסוגלים לצמיחה בודדים לצלחות אגר תמצית מאלט טרי בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של Hygromycin B.To להעריך את ההשפעות של שיבוש גנים ממוקד על היכולות ההטרותוליות של הפטרייה, במשותף תמצית מאלט טרי אגר בינוני עם זן מוטציה אחד, כמו גם זן של סוג הזדווגות מנוגד.
כאשר עובדים עם H.omanensis, לכסות אבל לא לאטום את הצלחות. מניחים את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך שבעה ימים. בסוף הדגירה, להעריך חזותית לייצור מבנים מיניים.
כדי לבדוק את היכולות homothallic של זן מוטנטים, לחסן תמצית מאלט טרי אגר בינוני עם זן מוטציה של עניין דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שבוע אחד כפי שהוכח. כדי להעריך את ההשפעות של ההפרעה על קצב הגדילה של הפטרייה הנחקרת, הכנס את החלק האחורי של קצה פיפטה סטרילי גדול לתוך הקצוות הגדלים באופן פעיל של התרבות של כל מוטנט וזן פראי של עניין כדי ליצור תקעים אגר מכוסה mycelial לחסן תמצית מאלט טרי אגר מדיום. יש לעשות לפחות שלושה שכפולים לכל סוג תרבות.
לאחר שלושה ימים של צמיחה ב 20 מעלות צלזיוס, למדוד את הצמיחה בכל צלחת על שני קטרים ניצבים. Conidia משמש כחומר ההתחלה של הפרוטוקול מותר לנבוט ולגדול עד שהם הופכים חיידקים צעירים. שים לב כי גדילים mycelial בוגרת כגון אלה הם בוגרים מדי עבור השפלה ואין להשתמש בהם.
כאשר לתאים כבר אין קירות תאים, הם הופכים רגישים מאוד לשיבוש מכני ומשחררים פרוטופלסטים עגולים שניתן לקצור לצורך טרנספורמציה. ההצלחה של הפרוטוקול יכולה להיות מאושרת על ניתוח פנוטיפי של הזנים המוטנטים. עבור מוטציה זו MAT 127 לבודד, קצב הצמיחה הרדיאלי וגטטיבי הופחת באופן משמעותי, מה שמרמז על אפקט pleiotropic עבור גן ההזדווגות הרומן.
יתר על כן, מבודד המוטנטים לא היה מסוגל להשלים מחזור מיני לייצר רק מבנים מיניים לא בוגרים שלא ייצרו נבגים מיניים בהשוואה לבידוד מסוג פראי שהשלים את כל המחזור המיני בתוך ימים ספורים של דגירה. RNA הוא רגיש מאוד משפיל בקלות רבה. לכן, סביבת עבודה נקייה ולעבודה מהירה על קרח חיוניים להצלחת הניסוי.
לאחר בידוד מוטנטים נוצרו בהצלחה, הם יכולים להיות נתונים לניתוח פנוטיפי או RNA-seq בהתאם לגן המאופיין.
