פרוטוקול זה כולל אסטרטגיה כימית חדשנית לצירוף פפטידים טיפוליים למשטחים מתכתיים, ויש לו פוטנציאל לשפר את התאם הביולוגי של מגוון רחב של ביו-חומרים מתכתיים. זוהי טכניקה אוניברסלית וחזקה לצרף פפטידים וחלבונים טיפוליים למשטחי המתכת החשופים של ביואימפלנטים. השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לשפר את תאימות הביולוגית של סטנטים מתכתיים על ידי צירוף פפטידים CD47 על מנת למנוע את התגובות דלקת המופעלות על ידי סטנטים.
התחל על ידי שטיפת קופונים רדיד נירוסטה או דיסקים רשת עם 2-isopropanol בשייקר במשך חמש דקות. בצע שטיפה זו פעמיים, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות פעמיים עם כלורופורם במשך 10 דקות לכל לשטוף. מניחים את דגימות נירוסטה נקי בתנור ב 220 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
טובלים את רדידים אפויים או דיסקי רשת ב 0.5% פתרון מים של PABT ו דגירה אותם בשייקר במשך שעה אחת. שטפו את הדגימות שעברו שינוי PABT עם מים מזוקקים שעברו דה-יון חמש פעמים. מעבירים את הדגימות לבקבוקון חדש וחוזרים על השטיפה.
לטפל בדגימות עם TCEP במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. דגה deionized מים מזוקקים בבקבוקון תחתון עגול עם מכשיר יצירת ואקום, כגון ליופילייזר, ולשטוף את רדידים או דיסקים רשת עם מים degassed חמש פעמים. מעבירים את הדגימות לבקבוקון חדש וחוזרים על השטיפה.
הכן חמישה מיליליטר של 1%PEI-PDT פתרון על ידי דילול 212.5 microliters של המניה PEI-PDT ו 125 microliters של 0.4 אצטט נתרן טוחנת במים degassed. הדגירה דגימות נירוסטה שטף עם 1%PEI-PDT. מחליפים את האוויר בגז ארגון, אוטמים את הבקבוקונים אטומים ומערבבים אותם על שייקר למשך שעה.
המשך מיד עם ההטיה פפטיד או לאחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. הכינו מיליגרם אחד למיליליטר של פפטיד אנושי CD47 על ידי המסת אבקת פפטיד CD47 אנושית בחומצה אצטית 50%, ולאחר מכן הכינו את פתרון העבודה על ידי המסת 500 מיקרוליטרים של המניה ב-4.5 מיליליטר של PBS מפונק. הדגירה דגימות מצופות PEI-PDT שטף עם פתרון העבודה של CD47 פפטיד בטמפרטורת החדר עם רועד במשך שעה אחת.
בסיום, שטפו את הדגימות מצופות הפפטיד CD47 כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר ציפוי רדידי המתכת עם פפטיד CD47 או פפטיד מקושקשות, חותכים צינורות PVC בגודל רבע אינץ' לשלוש חתיכות באורך 38 ס"מ ומכניסים עד שמונה פפטיד מקושקשות ללא שינוי או פפטיד CD47 שונה לשלושה צינורות שונים. לאסוף 30 מיליליטר של דם מתורמים אנושיים בריאים ללא תרופות נגד טסיות דם, מראש טעינת המזרק עם מיליליטר אחד של 4% נתרן ציטראט כדי למנוע קרישה של הדם שנאסף.
שים 10 מיליליטר של דם לתוך כל צינור באמצעות מזרק 10 מיליליטר ולחבר את הקצוות עם מתאמי מתכת. מניחים את הצינורות המלאים בדם על גלגלי מנגנון לולאת צ'נדלר ומעבירים את הדם לאורך רדידים מתכת על ידי סיבוב גלגל ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. מסננים את הדם מהצינורות ולהיפטר ממנו על פי דרישות IRB, ואז לחתוך את הצינורות עם אזמל כדי לאחזר את רדידים.
הכן 2%glutaraldehyde פתרון על ידי דילול 70% פתרון במאגר ק קוריקט נתרן עם 0.1 נתרן כלורי טוחן. הדגירה את רדידים בתסכום 2% glutaraldehyde במשך 15 דקות ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה. לפני ניתוח רדידים מתכת, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.
חם שמונה מיליליטר של PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הכן פתרון מלאי צבע CFDA 10 מילימולאר על ידי הוספת 90 microliters של DMSO לבקבוקון CFDA אחד, ולאחר מכן להכין את הפתרון עובד על ידי הוספת 75 microliters של CFDA המניה PBS חם. להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב ולכסות אותו עם רדיד אלומיניום.
מניחים כל רדיד אלומיניום למיליליטר אחד של צבע CFDA בצלחת 24 באר. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדרגים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז שוטפים את הרדידים שלוש פעמים ב-PBS ומדמיין אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי. הריכוז של פפטיד פפטיד אצמוי טמרה כבול באופן קוולנטי CD47 היה מכומת כדי לקבוע צפיפות קיבוע מקסימלית של הפפטיד על פני המתכת.
שימור פפטיד מקסימלי היה כ 180 ננוגרם לס"מ בריבוע, אשר הושג עם ריכוז קלט של 100 מיקרוגרם למיליליטר. קיבוע של פפטיד טמרה אציבה CD47 על משטחי מתכת שונה היה מאומת עוד יותר על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות, אשר הראה פלואורסצנטיות אחידה הנפלטת מפני השטח של תקליטורי רשת פפטיד אצטראד TAMRA הוסיף 47 מטופלים. רק פלואורסצנטיות מינימלית זוהתה על פני השטח של רשתות הבקרה שלא היו חסרות את השינוי, ובכך לא כולל פפטיד טמרה לא קשור במיוחד CD47 כמקור העיקרי של פלואורסצנטיות.
זה גם אושר כי משטחים מצופים CD47 פפטיד להראות ירידה דרסטית בהחזקת תאים המועברים בדם לעומת פקדי פפטיד מקושקשות שונה ללא שינוי. מונוציטים מבודדים מתאים מעיל באפי חולדה היו מתורבתים על מתכת חשופה פפטיד CD47 שונה רדידים נירוסטה. נחיתה של 58% של התקשרות מונוציטים חריפה, המרתם למאקרופאגים והתפשטות מקרופאג נצפתה על המשטחים הפונקציונליים.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב מאוד לבצע את השלבים הכרוכים במים מגזים או רייגנטים להתבצע מהר ככל האפשר כדי למזער את החשיפה לחמצן. הטכנולוגיה שלנו מווסתת באופן סלקטיבי את האינטראקציה התאית עם משטחי מתכת וראיה אופיינית לזיהוי סוגי תאים, כגון RT-PCR, ציטומטריית זרימה ושפעת חיסונית, תואמים לטכניקה זו. כאשר פותח עבור מגוון של פפטיד ביואקטיבי, טכנולוגיה זו יכולה להיות אינסטרומנטלית בהגדלת תאימות ביולוגית בממשק חומר הרקמה.
