מחקר זה מומן על ידי מענקים שהוענקו לRLM מהמועצה הלאומית לבריאות והמחקר הרפואי של אוסטרליה (מענק # 606,658).

1. תרבית תאים (3-7 ימים לפני אסיפת BBB) 1.1. תאי המוח אנושי כלי הדם האנדותל ראשיים (BECs) BECs התקבלו באופן מסחרי. התאים יוצרו על ידי ניתוק dispase של רקמת קליפת המוח האנושי נורמלית ובתנאי קפוא במעבר 3 (&lt;12 הכפלות אוכלוסייה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התשתית: כלי פרווה רקמות תרבות עם &quot;פקטור קובץ מצורף&quot; לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקה נייד: שמור על BECs בינונית מלא המכיל סרום. לניסויים, תרבות BECs במדיום סרום ללא מוחלט. לשמור על התאים ב5% CO 2 humidified, 21% O 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס הערה: כחלופה לחומרים כימיים מיוחדים, 0.1% (w / v) פתרון לטין יכול לשמש כמגיב ציפוי תוך DMEM/F-12 תוספת 15 HEPES מ&quot;מ, 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS), L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 50 מיקרוגרם/ מיליליטר gentamycin, 20 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין ו20 מיקרוגרם / תוסף צמיחת תאי האנדותל מיליליטר ניתן להשתמש בם לצורך תחזוקת BEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת culturing לניסויים: BECs מחוברות פיצול ביחס של 1:03-1:06, תלוי בזמן המיועד לשימוש הבא (3-7 ימים). לשנות את מדיום התחזוקה כל 3 ימים. השתמש BECs עד 15 מעברים. </li></ol> 1.2. תא אונליין SVG האדם העוברי astroglial תאים עובריים האנושיים SVG astroglial 22 נגזרו במקור מתרבויות עיקריות של מוח העוברי של אדם הפך עם נגיף סימיאן הכפול מחסרת 40. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקה: תרבות תאי SVG במדיום חיוני מינימאלי עם תמיסת מלח מאוזנת של ארל בתוספת 20% (v / v) FCS (אותו אחוז בסרום משמש כדי לשמור על התאים הראשוניים של הוריהם 22), 2 L-גלוטמין מ&quot;מ, 50 / ml פניצילין U ו 50 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מיליליטר. לשמור על התאים בhumidified 5% CO 2, 21% O 2 </תת&gt; חממה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת culturing לניסויים: SVGs מחוברות פיצול ביחס של 1:05-1:10, תלוי בזמן המיועד לשימוש הבא (3-7 ימים). ההסרה של טריפסין לא נדרשה בשל התכולה הגבוהה של סרום במדיום. לשנות את המדיום כל 3 ימים. השתמש SVGs עד 20 מעברים. </li></ol> 2. הרכבה וCoculturing של האדם במבחנה BBB הדגם (יום 0) הערה: האדם במודל BBB קשר מבחנה מוכן על פי פרוטוקולים שפורסמו 13,23, עם שינויים. 2.1. ציפוי של תוספות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מוסיף רקמות תרבות (6.5 מ&quot;מ קוטר עם קרום נקבובי פוליאסטר, 3 מיקרומטר נקבובית בגודל) בבארות של צלחת 24 גם סיפקה. מעייל את פני השטח luminal של מוסיף <s> </s> לילה חממה 37 מעלות צלזיוס humidified עם קולגן עכברושי (20 מיקרוגרם / 2 סנטימטר; 50 μl של 132 מיקרוגרם/ מיליליטר קולגן אני ב0.02% חומצה אצטית במים מילי-Q (MQH 2 O)). שטוף מוסיף פעם אחת (שניהם מהצד abluminal וluminal) עם MQH 2 O להסיר את החומצה יורית. הערה: קרום במרתף של נימי דם במוח לא מכיל קולגן אני אבל בעיקר laminins, isoforms סוג IV קולגן, nidogens, וproteoglycans סולפט heparan 9. מסיבה זו, חלק מהחוקרים לנצל סוכני ציפוי כגון IV קולגן, פיברונקטין 13, או Matrigel (מדעי החיים BD) 16 לדוגמנות BBB יותר אותנטית. </li></ol> 2.2. SVGs זריעה על המשטח התחתון ממברנה (Abluminal) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הכנס ובעדינות שיתאים סביב השפה של הקרום הנקבובי חתיכת צינורות סיליקון אלסטי קצרה (&quot;צינורות חיצוניים&quot;; קוטר ~ ארוך 10 מ&quot;מ, 8 מ&quot;מ פנימי, 1.6 קיר מ&quot;מ), ויוצר במהותו חדשה גם מעל פני השטח abluminal (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחתון של בית הכנסds להיות אטום כדי למנוע דליפת תקשורת. ראשית, להכין את תקע (איור 2 א ו -2 ב) עשוי מצינורות סיליקון (שמכונים &quot;צינור פנימי&quot;; ~ עוד 8 מ&quot;מ, 3.2 מ&quot;מ קוטר פנימי, קיר 1.6 מ&quot;מ; איור 2), אטום בקצה אחד עם קונוס איטום פלסטיק (~ 3 מ&quot;מ ארוך; שהוכן על ידי חיתוך החלק התחתון של תגובת 0.2 מיליליטר פולימראז שרשרת (צינור PCR); איור 2). חרוט זה חותם לא רק לום צינורות הפנימי, אלא גם מרחיב את הקצה שלה להתאמה הדוקה יותר להוספה. בשלב בא, באמצעות מלקחיים סטריליות, להכניס את תקע סיליקון לתוך חלל luminal ולקדם אותה עד שהוא מגיע 1-2 מ&quot;מ של עד ~ מן הקרום (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, זרע 4 x 10 4 תאי SVG ב200 בינוני תחזוקת SVG μl (se1.2.2 ction לעיל) ישירות לתוך סיליקון היטב מעל פני השטח קרום abluminal (איור 2 א). לאפשר SVGs לדבוק לפחות 4 שעות בחממה. הערה: כדי לשמור על סטריליות להעביר מוסיף התאסף בין שתי 6 גם צלחות (צלחת אחת הפוכה מעל אחרים; איור 2C) כדי לצמצם את החשיפה לאוויר לא מסונן במהלך ההליך. צינורות סיליקון ותקעים נשטפים באתנול וautoclaved לשימוש מאוחר יותר. הערה: תקעי שימוש (סעיף 2.2.2) רק מוסיף עם נקבובית קרום גדלים גדול יותר מאשר 1 מיקרומטר. ממברנות בקוטר נקבובית ≤ 1 מיקרומטר לעתים רחוקות דליפה ודורשות רק ההתאמה של הצינור החיצוני סיליקון (סעיף 2.2.1). בנוסף, חלק מסוכני הציפוי אחרים מאשר קולגן אני (ראה הערה בסעיף 2.1) עלולים למנוע דליפות אפילו עד 3 מיקרומטר נקבוביות. לקבוע באופן אמפירי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לפקח על מצב הדבקות של האסטרוציטים שלך, זרע במקביל ל96, גם נפח זהה סטנדרטי של תא ההשעיה astrocyte. יש גם את זה את אותו שטח פנים כמו להכניס 6.5 מ&quot;מ (0.33 2 סנטימטר) ומאפשר הדמיה קלה יותר של תאים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד מאשר הקרום להוסיף. כשאתה מתבונן דבקות מספקת של astrocyte בשליטה 96 היטב, האסטרוציטים לי כראוי דבקו גם על הקרום להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר האסטרוציטים יש דבק מספיק בשליטה 96 היטב, להעביר אסיפות להכניס למכסת המנוע בתרבית הרקמה (ראה הערה לעיל) ובעדינות להסיר את צינורות סיליקון החיצוניים ותקעים. לחזור מוסיף לכיוון הרגיל (כלומר זקוף) לתוך הבארות סיפקו מכילות 800 μl / טוב של מדיום BEC תחזוקה (סעיף 1.1.2 לעיל). </li></ol> 2.3. זריעה של BECs ללשכת לומינל מעל האסטרוציטים זרעי 2x10 4 BECs ב200 μl על פני השטח luminal מצופה קולגן ולהחזיר את inseRTS לתוך החממה. 2.4. Coculturing Coculture מוסיף SVG / BEC נזרע במשך 3 ימים במדיום BEC ללא שינוי תקשורת לפני הניסויים. 3. ניסויים עם דגם BBB האנוש (יום 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר את התאים במבחנה הכביסה הראשונים BBB על ידי החלפת כלי תקשורת abluminal וluminal עם 600 μl ובינוני BECs סרום ללא 100 μl, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום luminal שוב ולהחליף עם של מדיום סרום ללא 100 μl עם סוכני מגרה. הערה: אם גירוי של חדר abluminal נדרש (כדי להפעיל את במבחנה BBB מתא astrocytic), לשאוב את מדיום abluminal ולהחליף עם 600 ul של מדיום סרום ללא גירוי עם סוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק כל קבוצת ניסוי בשלושה עותקים (ומכאן, אם גירוי luminal מבוצע, אשר דורש 3 x 100 μl, אנו ממליצים על דילול מחדש<html> סוכנים לריכוזים הסופיים שלהם ב350 μl של מדיום סרום ללא לכל קבוצה כדי למזער שגיאות pipetting בין בארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע paracellular סטנדרטי ו / או מבחני חדירות transcellular של קליעים נותבים שכותרת 16,24 (עבור האחרונים אנו משתמשים isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות אלבומין) ו / או מדידה של Teer 13,16,25 כפי שתואר לעיל. </li></ol> כדי להסביר את תנודות בחדירות תחילת המחקר בין ניסויים, לנתח שינויים בביחס חדירות להוספה מצופה ללא תאים (המשמש כנקודת התייחסות לחדירות מקסימליים) ולקבוצה שטופלה ברכב תוך שימוש בנוסחה: חדירות (% ממקסימום) = ( ערך חדירות של הכנס ניסיוני - ערך חדירות ממוצע של קבוצת הרכב) / (ערך חדירות של להכניס הריק - ערך חדירות ממוצע של קבוצת הרכב) X 100. 4. ויזואליזציה של תאים בממברנות נקבוביות NT &quot;&gt; הערה: תאים בלא כתם על קרומים להוסיף קשים להתבונן בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת מיקרוסקופיה (DIC) מאז הקרום הוא די אטום ומפריע להעברת אור כדי להתמודד עם בעיה זו פיתחנו נהלי צביעה שונים של תאים ב. מוסיף, אשר מאוד לשפר את המראה של תא על הממברנה. באופן כללי, להכתים את הקרומים להכניס ועדיין מחובר להוספה, בבארות. הקרומים יש להסירם רק בסוף ההליך מכתים למטרות הרכבה. 4.1. Hematoxylin מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) paraformaldehyde (PFA) ב פוספט בופר סליין (PBS; 130 mM NaCl, 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 10 מ&quot;מ אא 2 PO 4, pH 7.2) עבור 20 דקות. לשטוף פעם ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הכנס בפתרון hematoxylin של 0.1% מאייר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את התוסף במים ברז (על ידי השריית את כל הפרטיםERT במים ברז וכוס המכילה pipetting בעדינות את המים העודפים). להעביר את הכנס לפתרון של סקוט במים ברז (2 גר &#39;/ ל&#39; NaHCO 3, 20 g / L MgSO 4) ל~ 20 שניות עד שהצבע הכחול הרצוי מתפתח. שטוף את הכנס שוב במים ברז (סעיף 4.1.3). כתם eosin אופציונלי יכול להיות הציג כאן על ידי טבילה את הכנס ב1% פתרון eosin ל10 שניות ואחריו שטיפה במים ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש הקרום להוסיף. באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום) להסיר את הקרום ולעגן אותה בשקופית זכוכית הדמיה בהירה שדה הערה: אם הרכבה בינוני di-N-butylphthalateinxylene (DPX) מנוצל לשטוף להכניס את עם 100% אתנול ואחריו קסילן לפני הסרת והתקנת הממברנה. </li></ol> 4.2. מיקרוסקופ האלקטרוני סורק (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) PFA ב PBS עבור 20min. לשטוף שלוש פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את הקרומים ל30 דקות ב1% (w / vtetroxide אוסמיום) בMQH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף מוסיף במים (סעיף 4.1.3) ולייבש בשיפוע הסלמת אתנול (50%, 70%, 90% במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן 3x עם אתנול 100% עבור 10 דקות להפסקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק מוסיף מיובש בתערובת של hexamethyldisilazane (HMDS): אתנול (1:2 אז 2:01 במשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק מוסיף עם HMDS 100% למשך 5 דקות, אוויר יבש ולאחסן בתנאים יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הקרום באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום). לבחון קרומים ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים. </li></ol> 4.3. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) PFA ב PBS עבור 20 דקות, לשטוף פעם שבנאגר מלוח טריס (TBS; 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.6, 154 mM NaCl, 0.22 מיקרומטר מסוננים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunostaining של התאים על הקרום להוסיף כמתואר 26 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הקרום באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום) ולעלות אותו על AGשקופית ילדה עם הרכבה בינונית הקרינה. בחן את הקרום על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.</a> Neuron. 57, 178-201 (2008).</li><li>Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+plasminogen+activator+on+the+neurovascular+unit:+from+clinical+data+to+experimental+evidence.">Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).</li><li>Stewart, P. A., Wiley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+nervous+tissue+induces+formation+of+blood-brain+barrier+characteristics+in+invading+endothelial+cells:+a+study+using+quail--chick+transplantation+chimeras.">Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras.</a> Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).</li><li>Janzer, R. C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells.">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325, 253-257 (1987).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).</li><li>Girouard, H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+coupling+in+the+normal+brain+and+in+hypertension,+stroke,+and+Alzheimer+disease.">Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease.</a> J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).</li><li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+physiology,+pathology,+and+pharmacology.">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(muBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB).</a> Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).</li><li>Gaillard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+functional+characterization+of+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier,+comprising+a+co-culture+of+brain+capillary+endothelial+cells+and+astrocytes.">Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes.</a> Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).</li><li>Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+astrocytes+induce+the+expression+of+blood-brain+barrier+specific+proteins+by+autologous+endothelial+cells.">Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells.</a> Brain Res. 625, 238-243 (1993).</li><li>Demeuse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+coculture+of+rat+brain+endothelial+cells+and+astrocytes:+a+syngenic+model+to+study+the+blood-brain+barrier.">Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier.</a> J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).</li><li>Coisne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+syngenic+in+vitro+blood-brain+barrier+model:+a+new+tool+to+examine+inflammatory+events+in+cerebral+endothelium.">Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium.</a> Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).</li><li>Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+gap+between+the+in+vivo+and+in+vitro+blood-brain+barrier+tightness.">Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness.</a> Brain Res. 1284, 12-21 (2009).</li><li>Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+blood-brain+barrier+by+glucocorticoids+and+the+cells+of+the+neurovascular+unit.">Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).</li><li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling:+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies.">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+endothelial+and+astrocyte+cocultures:+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+delivery+studies.">Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).</li><li>Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+In+Vitro+Models+of+Ischaemic+Stroke:+a+Test+Bed+for+Translation.">Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation.</a> Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).</li><li>Major, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+line+of+human+fetal+glial+cells+that+supports+JC+virus+multiplication.">Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).</li><li>Eugenin, E. A., Berman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-dependent+mechanisms+of+leukocyte+trafficking+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier.">Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier.</a> Methods. 29, 351-361 (2003).</li><li>Dehouck, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier:+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+models.">Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models.</a> J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).</li><li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li><li>Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin-induced+activation+of+astrocytes+in+mixed+rat+hippocampal+cultures+is+inhibited+by+soluble+thrombomodulin.">Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin.</a> Brain Res. 1381, 38-51 (2011).</li><li>Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endothelial+and+astrocyte+co-culture+model+of+the+blood-brain+barrier+utilizing+an+ultra-thin,+nanofabricated+silicon+nitride+membrane.">An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane.</a> Lab Chip. 5, 74-85 (2005).</li><li>Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=t-PA-specific+modulation+of+a+human+BBB+model+involves+plasmin-mediated+activation+of+the+Rho-kinase+pathway+in+astrocytes.">t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes.</a> Blood. , (2012).</li><li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine+increases+the+permeability+of+primary+mouse+cerebral+endothelial+cell+monolayers.">N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers.</a> Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nat. Med. 14, 731-737 (2008).</li><li>Yepes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+induces+opening+of+the+blood-brain+barrier+via+the+LDL+receptor-related+protein.">Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein.</a> J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke.">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li><li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke:+an+update.">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

מחקר רפואי לפתולוגיות מוח סובל קושי רב translational. באזור של שבץ איסכמי חריף, למשל, תרופות רבות אשר הראו הבטחה גדולה במודלים של בעלי חיים נכשלו במרפאת 38,39. הסיבות לתוצאות מאכזבות אלה הן מגוונות וכוללות בגידה של מערכות בדיקה קליני לתרחיש שבץ אדם וההגזמה של תוצאות שהתקבלו ממחקרים בבעלי החיים 21. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את הערך המנבא של ממצאים קליניים אל השלב הקליני היא פיתוח נוסף של אדם במבחנת מודלים מבוסס תאים, אלה עשויים לספק כלים רבי עוצמה וחסכונית להקרנת סמים ומנגנוני רומן ולאפשר טוב יותר תוך התמקדות באפיקים קלינית רלוונטיים 21. במסגרת זו, שתוארנו כאן בפירוט את התהליך שנעשה במעבדה שלנו להקמת מודל BBB המגע אנושי, תוך ניצול שילוב רומן של אסטרו האנושי הונצחcytes (SVGs) וBECs האנושית העיקרית לבדיקה של תופעות הקשורות לאירוע מוחי. תחת תנאים סטטיים (ללא זרימה), פנה לדגמי BBB (איור 1) דומה ביותר in vivo המבנה האנטומי ומוצגים להיות מעולה במאפייני מכשולם 13,17,18. חשוב לציין, קשר אמיתי בין BECs והאסטרוציטים מתרחש רק בממברנות בקוטר גדול יותר נקבובית (≥ 1 מיקרומטר), המאפשר מעבר של קצה רגליים astrocytic והאינדוקציה הבאה של monolayers הדוק יותר (פחות החדיר) BEC 14,15,27. עם זאת, הזריעה של האסטרוציטים במוסיפים הפוך עם גודל נקבובית גבוה יותר - האלמנט הטכני הליבה בהכנת מודל BBB קשר - מהווה אתגר כפול טכני, שכן בנוסף לנפח הבינוני המוגבל אשר ניתן להוסיף ל6.5 מ&quot;מ ההפוך מוסיף (~ 50 ul), הקרומים הם גם נוטים לזליגה של מדיום בשל הקוטר הנקבובית הגדול שלהם. מגבלות אלה יכולים להפוך את ASTזריעת rocytic מסורבלת ולא עקבי. הטכניקה החדשנית שלנו לזריעת האסטרוציטים על מוסיף הפוך עם 3 מיקרומטר נקבוביות מציעה פתרון פשוט אך יעיל להליך זה. על ידי יצירת סיליקון נשלף, בלתי חדיר גם על גבי משטח abluminal השתפר מאוד ביכולתם של האסטרוציטים לדבוק בהצלחה לקרום הנקבובי. זה מאפשר צמיחה אחידה של האסטרוציטים על פני השטח abluminal ומאפשר הכנה לשחזור של מספר גדול של הכנסות להקרנה בו זמנית של הרבה פרמטרים ניסוי (למשל, ההקרנה שבוצעה לאחרונה שלנו מההשפעה של חמישה plasminogen-ממריצים שונים על BBB 28). לפיכך, למרות פשטותו, שמצאנו השיטה שלנו לשפר באופן דרמטי את התפוקה ואת איכות המחקר שלנו באמצעות מודל BBB איש קשר זה. מגבלה אחת של שיטת זריעת astrocyte היא הדרישה לטיפול ידני נוסף של מוסיף, שהנמל דק (10 μממברנות מ &#39;עובי). טיפול מוגזם או מחוספס יכול לגרום למייקרו קרעים ונזק לממברנה. לפיכך, השימוש בצינורות סיליקון רכים וגמישים הוא חיוני כמו ההרכבה / הפירוק צריך להתבצע בכוח מינימאלי. לגבי התפיסה הכוללת שלה, מודל BBB האנושי שלנו הוקם על בסיס פרוטוקול בעבר תאר 14,23 שמנוצלים במקור תאים אנושיים ראשוניים. למרות העליונות שלהם לדוגמנות BBB, חסרון אחד בתעסוקה של תאי מוח אנושיים העיקריים הוא חוסר היכולת לגשת באופן שגרתי רקמת מוח אנושית חי להפקה סדירה של BECs הראשונית והאסטרוציטים ו / או העלות הכרוכה בהשגתם באופן מסחרי. מכיוון שמודלי BBB רבים להחליף בהצלחה האסטרוציטים עיקריים עם האסטרוציטים הנציחו (למשל עם תאי גליומה C6 החולדה 29), זה היה סביר להעסיק האסטרוציטים SVG 22 כרומן, אפשרות בשפע וחסכונית עבור מודלים BBB אנושיים. היכולת של SVGs למשפיע לטובה על תפקוד מחסום BEC תוקף בעיקרון התאמתם ללימודי BBB. לעומת זאת, בחרנו לשמור BECs העיקרית במודל BBB לתפקיד הקריטי שלהם בBBB in vivo 1,2,9. חשוב לציין, culturing הממושך של BECs הראשונית יכול לגרום לדה לבידול והידרדרות של פנוטיפ BBB-הספציפי שלהם. זו אכן עשויה להיות ניכרת במערכת שלנו על ידי ערכי חדירות האנדותל גבוהים למדי לאלבומין. מסיבה זו, יש לנו השתמשתי במודל שלנו בעיקר באופן יחסי 28 (איור 4), תוך לקיחה בחשבון של חדירות הבסיס המוגבהת שלו. אם monolayer BEC אדם מאוד הדוק הוא רצוי תפקוד המחסום ניתן לשפר עוד יותר על ידי תוספת של חומרים כימיים כגון הידרוקורטיזון glucocorticoid 17 או AMP המחזורי עם מעכבי phosphodiesterase 13. BECs הונצחה אנושית, כגון שורת תאי hCMEC/D3 40, יכולה גם להיות מועסק על היכולת שלהם לשמור על TI טוב יותרצמתים ght לאורך זמן. עם זאת, תא קווי BEC לעתים קרובות להציג איכויות מחסום מופחתות לעומת נמוך המעבר העיקרי BECs 41,42 וצריכים להישקל בזהירות בגלל שינויים אחרים פוטנציאליים (כלומר ביטוי שינה של קולטנים על פני קרום תא). באופן קולקטיבי, השינוי מסוג astrocytic התא (כלומר העסקת SVGs) והשיפור המהותי בפרוטוקול זריעת astrocyte שלנו הביא בדור של מודל לשחזור, קל להרכבה ואותנטית BBB מגע האנושי. בהתחשב במגבלות שלה, מערכת זו יכולה לשמש ככלי שימושי עבור במבחנה חקירה לא רק של שבץ איסכמי חריף, כפי שהודגמנו כאן 28, אלא גם של כמה פתולוגיות אחרות במוח מעורב אפנון של BBB.

BBB הוא ממשק מיוחד בין מערכת העצבים המרכזית, מכריע אחראית לתחזוקה של עצירת דימום במוח זרימת הדם ההיקפית ו. היא כוללת תאים שונים במוח כלי הדם אנדותל (BECs) שמושפעים מבחינה תפקודית על ידי כמה מרכיבים תאיים וacellular (להלן) כדי ליצור שער חזק ודינמי אל המוח. בתנאים פיסיולוגיים BBB מגביל את המעבר של תאי דם, מרכיבי פלזמה וחומרים מזיקים, כל הפוטנציאל רעיל למערכת עצבים, למוח. במקביל, BBB סלקטיבי מחליף יוני מפתח וחומרים מזינים (גלוקוז וחומצות אמינו) ומוצרי פסולת המטבולית בין המוח ואת זרימת הדם כדי לשמור על סביבת מוח 1,2 בדיוק. בשנים האחרונות זה הופך להיות ברור כי כישלון של BBB מתרחש במגוון רחב של פתולוגיות מוח כרוניות, כגון מחלות ניווניות או הקשורים לדלקת (למשל מחלת אלצהיימר וmultiplדואר הטרשת נפוץ, בהתאמה) 3, כמו גם במצבים חריפים כמו שבץ איסכמי 4. מאפייני BBB הייחודיים של תאי האנדותל במוח (BECs) מושרים בעיקר על ידי סביבת מוחותיהם 5, ובפרט על ידי האסטרוציטים 6,7. יש הבנה גוברת כי תאים מסוגים אחרים, כגון pericytes 8, תאי עצב ומיקרוגליה 1,3, כמו גם את הקרום במרתף 9, לתמוך BECs ויוצרים יחד יחידה תפקודית מכונה &quot;יחידת העצבים וכלי הדם&quot; (NVU) אשר בו זמנית זוגות עצביים דרישות חילוף חומרים לנימי אספקתם 10. מעורבותם של BBB במצבים פתולוגיים בבסיס ניסיונות רבים לפתח מודלים BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר הקשורים ל-BBB 11,12. מודלים אלה שואפים לחקות קרובים ככל האפשר במאפייני BBB vivo על פי עיקרון NVU. במבחנה </em&gt; דגמי BBB בדרך כלל מסתמכים על monolayer של BECs קפוצת יוצרי צומת (בעיקר משור 13, אדם 14, עכברוש 15, עכבר 16, ו17,18 מקורות חזיריים), יחד תרבית על קרום נקבובי עם האסטרוציטים תמיכה (בהרחבה נסקר על ידי מעדניית et al. 11 2005). ניתן לגדל האסטרוציטים בתנאים ללא מגע ובחלק התחתון של תרבית רקמה, מופרד מBECs (טיפחה על פני השטח העליונים של הקרום) על ידי התרבות בינונית עדיין מתקשר עם BECs באמצעות גורמים מסיסים 16. בדגמים מתקדמים יותר שטוב יותר דומה למבנה האנטומי של BBB in vivo, האסטרוציטים נשמרים בתנאי התקשרות ותרבותיים ישירות בצד השני של הקרום בסמיכות לBECs 13,15,17 (איור 1). תצורה זו מאפשרת מגע פיזי בין BECs והאסטרוציטים, שהוקם כאשר פרויקט האסטרוציטיםהתהליכים שלהם דרך הקרום הנקבובי. חשוב מכך, למגע אמיתי להתרחש צריך להיות ≥ הנקבוביות 1μm בקוטר, שכן קצה רגליים astrocytic לא יכולות לעבור בגדלים קטנים יותר נקבוביות (כלומר 0.4 מיקרומטר) 14,15. יש לציין, מערכות BBB קשר הם הפגינו בחלק מהמחקרים להיות עדיף על עמיתיהם שאינם אנשי הקשר שלהם בנוגע להתנגדות שלהם טרנס אנדותל החשמלי (Teer) וערכי חדירות האנדותל של קליעים נותבים שונים 13,17,18. ממד נוסף של זרימת מדיה נוספה לאחרונה במספר במבחנה המודלים BBB ליישם כוחות גזירה לאנדותל לסימולציה קרובה יותר של כלי הדם במוח 12,19. מכשול טכני אחת להתגבר בעת יצירת מודל BBB קשר הוא הזריעה של האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הקרום הנקבובי. פרוטוקולים קודמים 13,20, שם האסטרוציטים היו פשוט זורעים בירידה של תקשורת על גבי בהוספת verted, אפשר פעמים זריעה קצרה בלבד (כלומר 10 דקות 13 או 2 שעות 20) שנמצאו בידיים שלנו לא הספיק לקובץ מצורף תא תקין. שימוש בשיטה בסיסית זו, תקופת התקשרות astrocyte כבר לא דורשת ניטור מתמיד של מוסיף על ידי פתיחה תכופה של החממה (גורמת לתנודות בטמפרטורה, חומציות ולחות), והוא גם נוטה לזריעת תא אחידה עקב דליפה של תקשורת הדרך הנקבוביות, במיוחד אם הנקבוביות גדולות יותר מאשר 1 מיקרומטר הם מועסקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול כללי להכנת מודל BBB ליצירת קשר. ההליך שלנו כולל את שיטה חלופית לתא זריעה על מוסיף הפוך, העוסק במגבלות שהוזכרו לעיל. השיטה מאפשרת לדבקות באין מפריע של האסטרוציטים על פני השטח קרום abluminal, בחממת equilibrated, במשך תקופה ארוכה של זמן. כתוצאה מכך, זריעה אחידה של האסטרוציטים מושגת אשר מגדילה את איכות מחסוםוממזער וריאציות חדירות בסיסי בין מוסיף. ככל שהשימוש בתאים אנושיים הוא חשוב למחקר אנושי רלוונטי 21, אנחנו בנוסף להפגין במאמר זה ניצול המסוים של שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והנציחו את האסטרוציטים אדם להקמת מודל BBB אדם מגע עם יכולת הקרנת תפוקה גבוהה . מאז שצפו בתאים בממברנות נקבוביות יכול להיות לנו גם טכניקות קשות, פרט מכתים אשר יכול לסייע בקביעת המפגש והמורפולוגיה של תאים על הקרומים נקבוביים. לבסוף, אנו מדגימים כיצד מודל BBB האנושי שלנו יכול להיות מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של activator plasminogen רקמות מהסוג (t-PA) - אנזים קריש קורע המשמש כאפשרות טיפול יחידה לשבץ איסכמי חריף - על BBB.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

מחסום דם המוח (BBB) ​​כולל נימים במוח בלתי חדירים, אבל להתאמה אשר בחוזקה לשלוט בסביבת המוח. כישלון של BBB כבר רמז באטיולוגיה של מחלות רבות במוח, יוצר צורך בפיתוח של אדם במודלי BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר קליני רלוונטי. בין דגמי BBB הרבים עד כה תיארו, סטטי (ללא זרימה), פנה למודל BBB, שם האסטרוציטים ותאי האנדותל במוח (BECs) הם cocultured בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי, התפתחה מערכת עדיין אותנטית פשוטה כדי לדמות את BBB עם קיבולת הקרנת תפוקה גבוהה. אף על פי כן הדור של מודל כזה מציב אתגרים טכניים כמה. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מודל BBB אדם קשר ניצול שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והאסטרוציטים אנושיים הונצחו. באופן ספציפי, אנחנו פירוט שיטה חדשנית לתא זריעה על מוסיף הפוך, כמו גם לציין inserטכניקות צביעת t ומדגימים כיצד אנו משתמשים במודל שלנו למחקר הקשורים ל-BBB.

כדי להקים אנושי, מודל BBB קשר שהיו לנו לטפח SVGs וBECs על ממברנות נקבוביות עם נקבובית בגודל 3 מיקרומטר, המוצג על מנת לאפשר מעבר של קצה רגליים astrocyte למגע עם תאי האנדותל 14,15,27,28. ייצוג סכמטי של המודל ליצירת קשר המלא מתואר באיור 1 (משמאל איור). האתגר הטכני העיקרי שהוצג על ידי מערכת מגע הוא הצורך זרע האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הממברנה. אנו מצליחים במשימה זו על ידי בעיקר יצירת סיליקון נשלף גם על גבי המשטח הממברנה abluminal תוך מניעת דליפה של תקשורת עם התוספת סיליקון נוספת שהוכנסה לתוך חלל luminal (איור 2). השיטה אפשרה תקופה אופטימלית, ללא הפרעה זריעה של SVGs (לפחות 4 שעות), אשר בתורו הפכה מאוד מחובר אל פני השטח הנקבובי עם אובדן תא מינימאלי. ואכן, 3 ימים לאחר זריעת שני SVGs ואפליקצית BECsאוזני מחוברות וכיסיתי את הקרום באופן אחיד, כפי ששפט מתמונות של מוסיף מוכתם hematoxylin (ראה סעיף 4.1; איור 3 א, פנלים משמאל). בנוסף, שני סוגי התאים נשמרו סמניהם תא ספציפי על ממברנות נקבוביות (דפוס מפוזר הכתמה של חלבון חומצי fibrillary גליה ב22 SVGs וביטוי של גורם פון Willebrand בגופי Wiebel-Palade ושלפוחית ​​cytoplasmic בBECs; איור 3 א, לוחות מימין) , נצפה על ידי immunofluorescence (סעיף 4.3). יתר על כן, מהדמית SEM (סעיף 4.2) התברר כי SVGs וBECs היו מסוגל לצמוח באופן ישיר על נקבוביות הקרום (איור 3 א, פנלי אמצע, ראשי חץ), תופעה אשר באופן מלאכותי תורמת לתפקוד המחסום הפיזי של במבחנה BBB קשר models1 3,28. מבחינה תפקודית, בנוכחות SVGs ערך אנדותל חדירות (PE) 16,24 של impro אלבומין 28 ניאוןved ~ פי 4 ביחס לBECs בלבד (p &lt;0.01, n = 4), מ0.574 ± 0.199 x10 -3 ל0.126 ± 0.028 x10 -3 סנטימטר / דקות ללא או עם האסטרוציטים (SVGs), בהתאמה. תוצאות Pe אלבומין אלה הן שווות ערך למחקר אחר באמצעות BECs עכבר עם תאי גליומה C6 החולדה 29. פרוטוקול הזריעה שלנו בהצלחה חל גם מבודדים טרי BECs עכבר העיקרית והאסטרוציטים עכבר עיקריים גדלו על 1 מיקרומטר נקבוביות. במודל עכבר המגע הזה השגנו מכשול פיזי סביר ולהעמסת נתרן נותב הידרופילי הקטנה (Pe = 0.83 ± 0.22 x10 -3 סנטימטר / דקה, n = 3). לפיכך, שיטת הזריעה שלנו יכולה להיות מורחבת להכנת דגמי BBB ממינים אחרים. התכונה הבסיסית ביותר של מודל BBB מגע היא היכולת של האסטרוציטים להקרין קצה רגליהם הדרך הנקבוביות הקרום לפנות פיזי לתאי אנדותל. כמה מחקרים שנעשו שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק לiDENאצדיק את האסטרוציטים תהליכים שעוברים ממשטח abluminal הקרום (שבו האסטרוציטים הם זורעים) אל פני השטח luminal, כהוכחת העיקרון כי קשר בין האסטרוציטים ו-EC סביר 14,15,27. בעקבות מחקרים אלה שצלמנו על ידי SEM קרום luminal לאחר זריעת SVGs על פני השטח abluminal. כפי שניתן לראות באיור 3 ב, astrocytic (SVG) קצה רגליים יכולים להיבחן עוברות דרך 3 מיקרומטר הנקבוביות לתוך תא luminal, המאשרות את הקשר שעלולים להתקיים בין SVGs וBECs זורעים על הנקבוביות של הממד הזה. באופן קולקטיבי, שיטת הזריעה שלנו הייתה פשוט, יעילה, והניבה מודל BBB קשר אותנטי. יש לנו מנוצלים מודל BBB המגע האנושי שלנו כדי לחקור את ההשפעה של t-PA, סוכן fibrinolytic, על BBB. מספר המאמרים הראו כי t-PA ייתכן שתוכל לגרום לפתיחה של BBB בעירוי לווריד שלה לטיפול בשבץ איסכמי חריף 30-33. אינטראקציה זו בין t-PA וBBB עשויה לתרום לסיבוכים הקשורים לדימום thrombolysis-Induced T-PA 4,34,35 ולכן כפוף למאמצי מחקר הנוכחיים. המחקרים שלנו במבחנה אישרו כי T-PA אכן הגדיל את החדירות של BBB בשלמות ב( איור 4 א) ריכוז ואופן תלוי זמן (איור 4), שהיו שניהם בטווח פרמקולוגית רלוונטי 36,37. יתר על כן, שינויים מורפולוגיים דרמטיים של האסטרוציטים SVG יכולים להיבחן על הקרומים נקבוביים לפרסם חשיפה לt-PA (איור 4C), טוען כי תגובות astrocytic לt-PA בבסיס פתיחת BBB-Induced t-PA. חקירה בוצעה לאחר מכן זיהתה כי T-PA מגרה האסטרוציטים באמצעות הפעלה של פלסמינוגן - המצע שלה טבעי - לplasmin פרוטאז החזק ורחב טווח. יתר על כן, T-PA וplasmin נמצאו כדי להפעיל Rho-kinase (ROCK) איתות בהאסטרוציטים, ומצור<html> של מסלול ROCK מנע פתיחת BBB-Induced T-PA 28. זוהי דוגמא טובה לאופן ניצול של דגמי BBB יכול להוביל לזיהוי של תהליכים ביולוגיים חדשים והזדמנויות טיפוליות. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50934/50934fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. תצורות המבוססות על הכנס במבחנת המודלים BBB. ייצוגים סכמטי של חשמל סטטי (ללא זרימה) במודלים של BBB מבחנה. בדגמים בסיסיים בתאי האנדותל במוח (ECs; כתום) בתרבית לבד על קרום נקבובי (צהוב). במתקדם יותר ECs גישות cocultured עם האסטרוציטים (ירוק). ניתן לגדל האסטרוציטים גם בתנאים שאינם תנאים ליצירת קשר, בתחתית הבאר (מימין), או על פני השטח abluminal של הקרום הנקבובי בתנאי מגע (משמאל).nk &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50934/50934fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. שיטה משופרת לזריעת astrocyte על פני הממברנה abluminal להכנת מודל BBB קשר. () insert הוא הפוך, חתיכת צינורות סיליקון (&quot;צינורות חיצוניים&quot;) קצרה התאספו מסביב שלה ותוספת סיליקון השתלבה החלל של האור. הרכבה זו יוצרת גם על גבי משטח abluminal ומונעת תקשורת מ דולף דרך הנקבוביות. יכולים להיות שנזרעו תאים בבאר ואפשרו לדבוק באין מפריע במשך פרקי זמן ארוכים (מימין) (ב) התוספת סיליקון שהוכנו מחתיכה נוספת של צינורות סיליקון (&quot;צינורות פנימיים&quot;), חתמה בקצה אחד עם קונוס אטימה ה מוכנס לתוך החלל שלה. (ג) ברגע שזרע,מוסיף התאסף מועברים בין שתי 6 גם צלחות (צלחת אחת הפוכה מעל השני) כדי למזער את הסיכון לזיהום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50934/50934fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50934/50934fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. ויזואליזציה של תאי האנדותל במוח (BECs) והאסטרוציטים על מיקרומטר קרום נקבובי 3) Hematoxylin (פנלים משמאל), מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM;. פנלים באמצע) ותמונות immunofluorescence (לוחות מימין) של SVGs (על פני השטח abluminal, 40,000 ל6.5 להוסיף מ&quot;מ, פנלים העליונים) וBECs (20,000 ל6.5 להוסיף מ&quot;מ על קולגן המצופה, פני השטח luminal, לוחות תחתון) גדלו על קרום 3 מיקרומטר נקבובי במשך 3 ימים (ללא coculturing). שני סוגי התאים מגיעים למפגש בתוך FRA הפעם<html> לי ולשמור על תא הסמנים הספציפי שלהם (חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP) לSVG וגורם פון Willebrand (VWF) בגופי Wiebel-Palade לBECs, לוחות מימין) על הממברנה. חץ ראשים בפנלי SEM להראות עוד יותר את היכולת של שני סוגי התאים לגדול באופן ישיר מעל ולכסות את הנקבוביות, ואילו חצים מייצגים גרעין תא. ברים סולם על תמונות SEM מייצגים 25 מיקרומטר (למעלה) או 20 מיקרומטר (תחתון). ברים סולם על תמונות immunofluorescence מייצגים 40 מיקרומטר. (ב &#39;) תמונות SEM של SVG קצה רגליים עוברות דרך 3 מיקרומטר הנקבוביות לluminal הודעה 3d שטח זריעה של SVGs (לבד) על פני הממברנה abluminal (BEC). תמונות אלה מאמתים את הפוטנציאל להתפתחות של קשר אמיתי בין SVGs וBECs במודל BBB האנושי שלנו. ברים סולם מייצגים 6 מיקרומטר בפנל השמאלי ו12 מיקרומטר בלוח השמאלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50934/50934fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> class = &quot;jove_content&quot;&gt; * לבירור נוסף של עמדת התאים עיין באיור 1 פנל משמאל,. <img alt="איור 4" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/50934/50934fig4.jpg" width="400px" /> איור 4. activator plasminogen רקמות מסוג הגידול (t-PA) בתיווך בחדירות BBB הוא מונע על ידי שינויים מורפולוגיים של האסטרוציטים. () ריכוזי t-PA הגדלת נוספו לתא luminal של האדם במבחנה BBB וחדירות הוערכו 24 שעות מאוחר יותר על ידי מעבר של אלבומין ניאון לתוך תא abluminal. t-PA מוגבר חדירות BBB באופן תלוי ריכוז. n = 4-6 לכל קבוצות, אבל T-PA 10nm, כאשר n = 2. *** P &lt;0.001 בהשוואה לכל קבוצות האחרות בדרך אחד ANOVA עם ניומן-Keuls פוסט הוק. (B) t-PA (1 מיקרומטר) נוספה לתא luminal של האדם בהמבחנה BBB במשך 8 שעות ו24 שעות לפני הערכת חדירות. כפי שניתן לראות, פתיחת BBB בתיווך-t-PA הייתה כבר לאחר 8 שעות גירוי משמעותי (70.26% מהמקסימום ב24 שעות), אך עלייה נוספת נצפתה ב24 שעות. n = 6, *** P &lt;0.001, ** P &lt;0.01compared לאפס בדרך אחד ANOVA עם ניומן-Keuls פוסט הוק. בשני (א) ו (ב), נקודות בארים / הנתונים מייצגות ממוצע ± SEM. (C) תמונות שדה בהיר נציג SVGs הצבעוני Haematoxylin (פנלים העליונים) או micrographs האלקטרונים סורק של SVGs (פנלים תחתון) על קרומים להוסיף פוליאסטר (גודל 3 מיקרומטר נקבובית) 24 הודעה שעה טיפול ברכב או T-PA (1 מיקרומטר). שינויים מורפולוגיים-Induced T-PA בולט ושיבוש של שלמות monolayer SVG ניתן לצפות, מה שמרמז כי תגובות astrocytic לt-PA בבסיס ההשפעה של t-PA בחדירות BBB. תמונות הן נציגם של שני ניסויים בלתי תלויים. ברים סולם על תמונות SEM repreנשלח 61 מיקרומטר (משמאל) או 120 מיקרומטר (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50934/50934fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier at JoVE.com

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K Views.  Monash University.  הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי. 

Video: Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

במבחנה חלחול של FITC טעון Ferritins מעבר מכשול עכברוש דם-מוח: מודל לחקר משלוח מולקולות Nanoformulated

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

לוציפר צהוב-מרקר חזק הקרנף מסמן במודל תא של מכשול הדם האנושי-מוח

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

השתלה של תיקון ביו-מודפס בתלת מיתד במודל מורין של אוטם שריר הלב

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

שיטת הזרקה איטית זעיר פולשנית חדשנית להפחתת פגיעה ברקמות

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

מחבר זרקור: שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...