קשה להעריך את תפקוד הסרקום בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים בשל הסרקומר הלא מפותח והמבולגן שלהם. באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטית, אנו יכולים כעת לגשת לקיצור סרקומר. אנחנו יכולים לדמיין סרקומרים ולהעריך את התפקוד שלהם במבחנה באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע וחלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטית.
באמצעות התמרה מבוססת AAV, אנו יכולים להרחיב את השיטה לכל תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים על ידי המטופל. שיטה זו יכולה להיות מורחבת להתפתחות של טיפול קרדיומיופתיה, כפי שניתן להשתמש בו כדי להעריך ישירות תפקוד לקוי sarcomere הקשורים למחלה במבחנה. שיטה זו שימושית בתחום הקרדיולוגיה, כולל מחקר קרדיולוגיה ילדים.
עם זאת, זה יכול להיות מיושם גם על המחקר של תפקוד שריר השלד, כגון מיופתיה. ביום מינוס ארבע אינדוקציה בידול, לצפות צלחת שש באר עם 0.5 מיקרוגרם לסנטימטר מרובע של למינין-511 E8 מדולל PBS עבור דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לקראת סוף הדגירה, לטפל בתאי גזע פלוריפוטנטים הנגרמים על ידי האדם עם טריפסין רקומביננטי במשך שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
כאשר התאים התנתקו, קציר תאים לבינוני בתוספת 10% FBS לספירה, ו resuspend התאים ב 1.25 פעמים 10 כדי 10 עד התא החמישי לכל שני מיליליטר של AK02N בינוני בתוספת למינין-511 E8 ומעכב ROCK לאחר צנטריפוגה. לאחר מכן, שאפו את תמיסת הציפוי מכל באר של צלחת ששת הטובות, וזרעו שני מיליליטר של תאים לתוך כל באר. תחזיר את הצלחת לאינקובטור תרבית התאים.
לאחר ארבעה ימים, התאים מגיעים ל-80% השפעה. החלף את supernatant בכל באר עם שני מיליליטר של RPMI בתוספת B27 ללא אינסולין בינוני בתוספת מעכב GSK-3 לבאר כדי לגרום לבידול. לאחר יומיים של בידול, בעדינות להחליף את המדיום עם שני מיליליטר של RPMI בתוספת B27 ללא אינסולין בינוני בתוספת מעכב קיפוד לבאר.
התאים היו צריכים להגיע ל-100% השפעה. ביום הרביעי של בידול, בעדינות להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של RPMI בתוספת B27 ללא אינסולין לבאר. התאים צריכים להישאר בצפיפות גבוהה, וחלקם אולי החלו לצוף.
ביום השביעי והתשע של בידול, להחליף את supernatant בכל באר עם שני מיליליטר של RPMI בתוספת B27 עם אינסולין בתוספת puromycin עבור תרבות קרדיומיוצית תאי גזע פלוריפוטנטים סלקטיבית. בשלב זה, יש לראות תאים מכים בתוך התרבויות. כדי להגדיר תרבות קרדיומיוציט שמקורה בתאי גזע pluripotent בדוגמת, השתמש תחילה בסרט תיקון כדי להסיר אבק מפני השטח של חותמת PDMS בהזמנה אישית, ולהטביע בקצרה את החותמת ב -70%אתנול.
השתמש בדאסטר אוויר כדי להסיר את האתנול מפני השטח בול, ולטפל בפני השטח עם חמישה עד 10 microliters של 0.5% MPC פולימר ואתנול. כאשר הפולימר התייבש לחלוטין, מניחים את החותמת על כיסוי פולימר בצלחת הדמיה של 35 מ"מ, ומניחים משקל על החותמת. לאחר 10 דקות, השתמש במיקרוסקופ קל כדי לאשר כי התבנית הועברה על כיסוי, לשטוף את הצלחת מכסה פעמיים עם PBS.
לאחר הכביסה השנייה, מצפים את כיסוי עם 0.5 עד מיקרוגרם אחד לסנטימטר מרובע של למינין-511 E8 מדולל ב 0.1% ג'לטין עבור דגירה של שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר. ביום 10 של בידול, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ואחריו טיפול עם מיליליטר אחד של טריפסין רקומביננטי לבאר במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הספירה, resuspend התאים ב 2.5 עד חמש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של RPMI בתוספת B27 עם אינסולין בתוספת ריכוז puromycin, וזרע מיליליטר אחד של תאים על הצלחת עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, להחליף את supernatant עם RPMI טרי בתוספת B27 עם אינסולין בתוספת puromycin, ולהחזיר את התאים אינקובטור תרבית התא, מרענן את המדיום פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע עד ימים 21 עד 28 עבור הדמיה. להדמיה בזמן-לשגות של קיצור הסרקום בתרביות PCCSM, החל שמן על העדשה האובייקטיבית פי 100 של מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי, ובחר תנאי הדמיה חיים בתוכנה המשויכת. כדי להשיג נתונים מייצגים טובים, בחר את קצב הפריימים הגבוה ביותר, הגדר את התריס לפתיחה והחל תריס של ארבע על ארבע בחיתוך של אזור הרכישה כדי להשיג את המרווחים הקצרים ביותר בין תמונות במהלך הדמיית זמן-לשגות.
אם קצב ההכאה של התאים נמוך, לעורר את התאים על ידי גירוי שדה חשמלי, ולהתחיל את הקלטת זמן לשגות, תוך טיפול כי השדה הדמוי נשאר במוקד במהלך ההדמיה. בסוף תקופת ההדמיה, שמור את התמונות של זמן לשגות בתיקיה מתאימה. כדי לנתח את התמונות של זמן-זמן, פתחו סדרה של תמונות בזמן ל-ImageJ, והתאמו את הבהירות והניגודיות של התמונות עד שניתן יהיה לראות בבירור את תבנית הסרקום.
בתפריט כלים נוספים, בחר SarcOptiM והקש Control Shift P ועל לחצן מיקרון אחד בסרגל הכלים כדי להשתמש בהוראות לכיול התוכנית. לאחר מכן למתוח קו על פני האזור של sarcomere לשמש כדי למדוד את קיצור sarcomere, ולחץ על AVI תא יחיד כדי להתחיל ניתוח קיצור sarcomere. הדמיה בזמן לשגות של sarcomere מסומן, בדוגמת תאי גזע pluripotent נגזר קרדיומיוציטים ניתן להשתמש כדי למדוד קיצור sarcomere בנקודות זמן שונות.
כדי להתגבר על אי-הארגון של סרקום שנצפו בדרך כלל בתרביות קרדיומיוציטים שמקורן בתאי גזע, חותמות PDMS ספציפיות יכולות לשמש לקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים בדוגמת גזע בדפוס פסים, המקדם צורת תא מוארכת ותבנית סרקומר מאורגנת יותר בהשוואה לתאים בתרבית באזור שאינו דפוס. תרביות דפוס גם מקדמות התכווצות סלולרית טובה יותר ומספקות פרופיל אורך סרקומר חלק בהשוואה לתאים שאינם בעלי תרבית. קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע pluripotent המועברים על-ידי AAV מבטאים אותות GFP סרקומריים לאורך הקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים כבר בשלושה ימים לאחר ההחלמה וניתן להשתמש בהם גם למדידת פרופילי התכווצות סרקומר.
יתר על כן, התוספת של גן עמיד blasticidin במהלך transduction יכול לשמש גם כדי להקל על דפוס פלוריפוטנטים נגזר תאי גזע בחירת קרדיומיוציט לטוהר של מעל 90%כדי להקל על ניתוח תמונה קל יותר ואיכותי יותר, זה חיוני כדי לזהות אזור עם sarcomeres לנוע ליניארית ולקבל תמונות בקצב הפריימים הגבוה ביותר. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להעריך את תפקיד ההתבגרות בחלבוני סרקומה כדי לחקור תפקוד לקוי של סרקומר במעבדה cardiomyocyte נגזר תאי IPS ספציפיים למחלה, שמקורם בחולה.
