BS נתמכה על ידי אוניברסיטה של ​​תכנית מחקר לסטודנט קיץ מילאנו-Bicocca הדרכה; מחקר נתמך מכספים של משרד בריאות האיטלקי ומשרד איטלקי לחינוך, אוניברסיטה ומחקר וFondazione Humanitas לGC, אנחנו מודה למיכאל VG Latronico לקריאה ביקורתית כתב יד.

1. תחזוקה ללא מזין וPassaging של שורות תאי iPS אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מנות Matrigel מצופים. הפשירו בקבוקון אחד של מטריקס ESC-מוסמך האנושי על קרח למשך שעה אחת ולדלל אותו ב25 מדיום DMEM-F12 מ&quot;ל. הוסף 1 מ&quot;ל לכל צלחת 35 מ&quot;מ (או כמויות מקבילות לשטח פנים אם נעשו שימוש במנות אחרות), שמירה על כל מה שעל קרח ולהבטיח כי כל הצלחות והצינורות הם מראש מקוררים. אטמים ברדיד אלומיניום. </li></ol> הערה: ריכוזי מניות Matrigel משתנות בהתאם למנה. הוראות דילול מצוינות בגיליון נתונים. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צלחות על קרח בלילה ולהסיר מקרח ביום שלמחרת. יכולות להישמר במקרר צלחות עד שבוע לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני המלא mTESR1 (או להפשיר בקבוקון של מדיום Nutristem) וH-ESM (בינונית ESC אנושי) בהתאם לטבלה שלהלן. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> קונצרט כלשהו סופי </td><td> עבור 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> החלפת סרום נוקאאוט (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Glutamax 100X </td><td> 2 מ&quot;מ </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוני ממ </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> 100 U / מ&quot;ל ​​- 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td><td> 900 μl </td></tr><tr><td> תוסף B27 - בלי Vitamina </td><td> 1% </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מוסף N2 </td><td> 1% </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נוק DMEM </td><td> - </td><td> 370 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> ניתן לאחסן בינוני מניית ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות. כדי להכין מדיום גידול מלא, FGF הבסיסי הוסיף רק beforהאכלת דואר בריכוז סופי של 20 ng / ml. </li></ol> הערה: שלם H-ESM מותנה בfibroblasts העכבר העוברי יכול לשמש במקום mTESR1 או Nutristem לתאי iPS. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צלחות מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשעת 2 ​​לפני passaging. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות passaged בערך כל 5 ימים, גם אם הם לא הגיעו לנקודת מפגש. מושבות לא צריכים להיות נוגעות ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלפת מדיום גידול עם 1 מ&quot;ל של dispase (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל, לפזר ממניות מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​10 PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הבחנה אזורים עם pipettes משך פסטרו זכוכית. אזורים כי יש להסיר כוללים מבנים דמויי מכתש או פיברוזיס במרכז מושבות, וכל התחום שבו תאים הפכו הופרדו ממושבות ושטוחות ונראה שנודדים החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס מתחת למכסת מנוע התרבות עד גבולות מושבה הפכו בהירים יותר ולהתחיל לנתק (בדרך כלל סביב דקות 5-7). Discarד dispase. לשטוף עם 1 מיליליטר H-ESM וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב1 מ&quot;ל H-ESM, השתמש מרים תא (דמוי מרית מגרד) למושבות קציר ולאסוף בצינור 15 מיליליטר אפנדורף. לשטוף עם 1 מיליליטר H-ESM ולהוסיף לצינור. ספין ב 1000 RCF למשך 4 דקות ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב1 מדיום גידול מחומם מראש מ&quot;ל (או mTESR1 או Nutristem). הימנע מפירוק גושים יותר מדי - פיפטה מעלה ומטה פחות מ 6-8x. לקבוע כמה תאים צריכים להיות מצופה ולהסיר תאים מיותרים (בדרך כלל 01:04 או 01:05 דילול), למשל עבור 2 צלחות ב1:5, להסיר 600 μl, ולאחר מכן להוסיף 1.6 מיליליטר מדיום טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Matrigel מצלחות. תאי מקום טיפה אחרים טיפה, הפצה באופן שווה על הצלחת. הימנע מטלטול הצינור באופן מוגזם, כמו זה יגרום לתאים לעבור לכיוון המרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם צינור בינוני 1 מ&quot;ל ופער בין צלחות. נפח סופי בכל צלחת צריך להיות 1.5 -2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית כל יום, פרט ליום שאחרי passaging. למרות זאת הואאידיאלי לשינוי היומיומי בינונית, זה עשוי להשתנות מדי פעם בתדירות של אחת לימים, אם לא יותר מ 2-3 ימים עברו מאז המעבר האחרון מבלי להשפיע על פוטנציאל pluripotency או בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש להקפיא שורת התאים, מחדש להשעות במקום ב1-2 מדיום הקפאת mFreSR מ&quot;ל באמצעות פיפטה 2 מ&quot;ל ומקום 1 מ&quot;ל / cryovial. בקבוקוני מקום בcryobox ב -80 מעלות צלזיוס והעברה לחנקן נוזלי בתוך 3-4 ימים. </li></ol> הערה: microdissection הידני של תאי iPS חייב להתבצע תחת stereomicroscope. (IVF) תחנת עבודה בהפריה חוץ גופית (IVF מתחנת עבודת KSystem למשל) משולבת עם stereomicroscope מאפשרת מניפולציה של התאים בתנאים סטריליים בזמן שהם שמרו על שטח פנים מחוממים. אם זה לא זמין, ניתן להעביר stereomicroscope מתחת למכסת מנוע זרימה למינרית קבועה. 2. גופי Embryoid צבירה והלב Induction <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום EBM-20 על פי הטבלה שלהלן. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> קונצרט כלשהו סופי </td><td> עבור 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סרום שור העובר (מוצא דרום אמריקה) </td><td> 20% </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוני ממ </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין - סטרפטומיצין </td><td> 100U/ml - 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Glutamax 100X </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> 50uM </td><td> 450 μl </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> השימוש בFBS ממוצא דרום אמריקה הוא קריטית לקביעת יעילות הבידול: תעסוקה של סוגים אחרים של סרה עלולה להשפיעתהליך ההתמיינות. כדי להכין EBM-20, חומצה אסקורבית תוספת מלאה (AA) לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. ניתן לאחסן את מדיום גידול שלם על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מפעם אחת בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות iPS קציר כפי שתוארו לעיל (שלבים 1.6-1.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend עדינות ב1 מיליליטר EBM-20 עם טפטפת מיליליטר 2. הימנע מפירוק גושים יותר מדי - פיפטה מעלה ומטה לא יותר מ 2-3x, בודק את הגודל של המושבות תחת stereomicroscope. צלחת על צלחות התקשרות נמוכות במיוחד ביחס 1:1 (למשל לצלחת 35 מ&quot;מ, השתמש 1 גם צלחת 6 היטב). יש לשטוף את הצינור עם 1 מיליליטר EBM-20 ולהוסיף לצלחת. </li></ol> הערה: הגודל של המושבות להשפיע על תהליך ההתמיינות, שליטה יעילות ועיתוי של אינדוקציה לב. צבירה של EBS הומוגנית בגודל הוכח כדי להפחית את השונות שנצפו במהלך בידול. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לשנות EBM-20 פעם אחת באמצעות מיקרוסקופ כדי למנוע מחדשmoval של EBS. שמור פיפטה הקרובה לקצה של צלחת, ולהסיר את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב -7 ביום, מתג EBS לצלחות מצופות 0.1% ג&#39;לטין והניח בעבר על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במידת צורך, ניתן להסיר ג&#39;לטין וצלחות יצאו מתחת למכסת מנוע תרבית תאי O / נ הוסף 35-40 EBS לכל צלחת 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו EBS על הכאה ושינוי אזורי EBM-20 פעמיים בשבוע. לסמן את האזורים שבו מכים נמצאים בחלק העליון של כיסוי המנה, כדי להקל עליהם לוקליזציה תחת stereomicroscope. אזורים המתקשרים אמורים להופיע לאחר כ 10-20 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אזורים עם התכווצות ספונטנית מופיעים, לעבור למדיום EBM-2 (להכין כEBM-20, עם 2% FBS במקום) ולבודד אותם כמתואר להלן בסעיף 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לבדוק תחומים אחרים למכות ולשנות בינוני פעמיים בשבוע עד שאזורי מכים נדרשים לניסויים נוספים. </li></ol> הערה: יעילות של תהליך הבידול תלויה מאוד במספר גורמים, קריטיים ביותר שלו הם הקווים הספציפיים הסלולריים ויצווה של סרום המשמשים כדי לגרום לבידול לב. כדי להשיג היעילות הגבוהה ביותר, שורות תאי בדיקה עבור פוטנציאל cardiomyogenic וקבוצות שונות של סרום. 3. מכות בידוד והתרבות תחומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מעיל 12 גם (4 ס&quot;מ אזור 2) או את הצלחות של עניין עם פיברונקטין 5 מיקרוגרם / 2 ס&quot;מ, בדילול מלא PBS לעשות מספיק נפח כדי לכסות את כל פני השטח לחלוטין (300 סך הכל μl לכל גם ב12 גם צלחות). שמור נחשף במכסת מנוע בתרבית תאים ולאפשר לו להתייבש. יכולות להיות עטופות צלחות ומאוחסנות על 4 מעלות CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר להכות אזור באמצעות זכוכית משך פיפטה פסטר ואזמל, במידת צורך. מעבירים לצלחות פיברונקטין מצופים עם טפטפת 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל EBM-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות את הצלחת כדי לציין את האזורים שבם הוסרו תאים ולשנות את המדיום. יכולות להיות כל הזמן צלחות לתקופה של עד חודש 1, כפי שאזורים אחרים עשויים להתחיל באכילה בשלב מאוחר יותר. </li></ol> הערה: אם גושי מכות קטנים יותר יש צורך, פיפטה אזור explanted מעלה ומטה מספר פעמים תחת stereomicroscope, עד שהוא נשבר לחתיכות קטנות יותר. זה יגרום אשכולות של כמה תאי מכות (ראה סרט 3). <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית פעמיים בשבוע עד מוכן לניתוחים. </li></ol> הערה: cardiomyocytes מתקבל מפרוטוקול זה יש מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים דמוי עוברי; התבגרות כלפי פנוטיפ כמו מבוגר ניתן לקבל על ידי הגדלת הזמן בתרבות להבדיל עוד יותר תאים אלה. 4. בידוד תאי מכות בודד וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות של 2 ס&quot;מ (הקאמריות מעיל אזור 4 2) או תומך מתאים אחרים עם פיברונקטין 2 מיקרוגרם / 5 ס&quot;מ מדולל PBS מספיק כדי לכסות את פני השטח כולו התרבות. אם נעשה שימוש בתמיכת זכוכית, מעיל עם laminin ופיברונקטין (5 מיקרוגרם / ס&quot;מ &lt;sup&gt; 2 כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר להכות אזור עם טפטפת / אזמל פסטר מהצלחות מהסעיף 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 1 מ&quot;ל פיפטה, תאים מעבירים צינור 15 מ&quot;ל המכיל 500 collagenase השני μl (480 U / מ&quot;ל ​​PBS עם Mg ו Ca) ודגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מנער את צינור פעם אחת במהלך הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה עם טפטפת μl 200. אם כל גושים יישארו, להעביר לטרי collagenase השני וחזור על שלב 4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.4 עד אין גושים גדולים נשארים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית collagenase עם 3 מ&quot;ל EBM-2 (לא AA). לאחר מכן ניתן להשאיר את הצינור מתחת למכסת המנוע במעמד מחומם עד צינורות אחרים מוכנים. צנטריפוגה ב RCF 1000 במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל 0.25% טריפסין / EDTA (בדילול ממנייה 0.5% ב1X PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שלב את השברים של digestions מאותה הדגימה ראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין עם 4 מ&quot;ל EBM-2 (לא AA). תאים עוברים דרך מחט 18G במזרק 2.5 מ&quot;ל אין לא יותרהאן 7x. צנטריפוגה ב RCF 1000 במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 1 מ&quot;ל EBM-2 לכל טוב וצלחת. תאים יכולים לשמש לניתוח פונקציונלי ומורפולוגי 2-3 ימים לאחר ציפוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+iPS+cells.">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li><li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

אין אינטרסים כספיים לחשוף.

יש תאי גזע pluripotent פוטנציאל להבחין באופן ספונטני לCMS, אם כי ביעילות נמוכה ושונות גבוהה בין שורות. פיתוח שיטות אינדוקציה רומן ולכן התמקד בשיפור היעילות של התהליך ונע לעבר פרוטוקולים יותר מוגדרים. עם זאת, רוב שיטות הבידול החדשות אלה הם מורכבים למדי, הדורשים תנאים מורכבים...

מבחינה היסטורית, החקירה של המנגנונים הגנטיים ומולקולריים הנהיגה פיתוח ומחלות של בני אדם הייתה מבוססת על הדור של מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטי. עם זאת, פנוטיפים אדם רבים אינם מצליח להיות משוכפלים בהצלחה בעכברים, בעיקר בגלל ההבדלים הביולוגיים הקיימים בין שני המינים. מצד השני, גישה לרקמות אדם עשוי להיות מוגבל, ולעתים קרובות אינו מאפשר מספיק חומר כדי להתקבל ללימודים ניסיוניים לעומק. תחום הביולוגיה לב וכלי דם סובל משתי המגבלות האלה: הפיסיולוגיה של הלב האנושי היא שונה באופן משמעותי מזה של העכבר, וכמות משמעותית של רקמת לב היא נגישה רק נתיחה שלאחר מוות או במהלך ניתוח לב. מציאת מקור אופטימלי לבידול של תפקודי האנושי CMS לכן הפכה נושא מרכזי בביולוגיה לב וכלי דם, והרבה מאמץ נעשה כדי לטפל בבעיה זו. סוגי תאים שונים הוצעו, אניncluding myoblasts שלד, תאים מקומיים לב גזע, תאי mononuclear מח עצם, תאי אב אנדותל, ותאי גזע mesenchymal. עם זאת, נתונים שהושגו באמצעות תאים אלה לא היו עקבי 4. הגזירה של תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) 5 והגילוי פורץ של (IPS) תאי גזע pluripotent מושרה על ידי יאמאנאקה ותומסון 6,7 נראו תחילה מאוחר יותר כדי לספק פתרונות: התאים הללו יש את היכולת לגדול ללא הגבלת זמן ואת הפוטנציאל לתת תעלה לכל נגזרי התא של שלוש השכבות הנבט, כולל מערכת ניהול התוכן. השימוש בתאי iPS מציע יתרונות נוספים: הנגזרים מתאי בוגרים אוטולוגי, הם נושאים את אותו הגנום כפרט או המטופל שממנו הם נובעים. לכן הם מאפשרים פיתוח של מודלים במבחנה המאפשרים החקירה של מחלות גנטיות באדם ובמנגנונים של התפתחות. בכוחו של מאפיין זה, תאי iPS יכולים גם oבעיות הקשורות לvercome דחייה חיסונית וסוגיות אתיות 8. מסיבות אלה, למרות שESCs עדיין מייצג את תקן הזהב בתחום הביולוגיה של תאי גזע, בכל העולם חוקרים כיום נעים יותר לכיוון טכנולוגיית תאי iPS. תאי iPS כעת מועסקים למודל מחלה אנושית במבחנה לתנאים שונים, כולל הפרעות מולדות 9,10 לב וכלי דם. לאחרונה, יישום של מודלים מחלה תא iPS נעשה להפרעות בלב monogenic (תסמונות QT ארוכות, טכיקרדיה חדרית כלומר פולימורפית catecholaminergic) ומוזרויות שבו מומי לב הם חלק מהפנוטיפ מורכב (כלומר Leopard ותסמונות טימותי, קרדיומיופתיה מורחבת). דוחות אלה אישר כי תאי iPS מטופל ספציפי הנבדלים לCMS להציג מאפיינים פנוטיפי ופונקציונליים דומים כמו המחלה בגוף חי. עם זאת, ישאתגרים עדיין רבים לשפר את היעילות של תאי iPS גרימת לשושלת לב. דור הספונטני של CMS מESCs אדם דרך היווצרות המצרפי נקרא גופי embryoid (EBS) הוכיחו 17 מוצלחים. מאז הגילוי הזה, שיטות רבות אחרות שהוצעו. קבוצות רבות הגבירו מאוד את היעילות של פרוטוקול הבידול ועברה לפעול בריאגנטים תרבות הגדרה כימית וללא בעלי החיים מוצר (ראה Mummery, ג, et al., מחקר מחזור (2012) לסקירה מקיפה של כל השיטות הקיימות 3 ). עם זאת, השיטה הקלסית המבוססת על צבירת EB עדיין מייצגת מועסק הנפוצה ביותר לביצוע מחקרים תפקודיים וחוקר מנגנוני מחלה. הפרוטוקול המוצע שלנו מבוסס על הצבירה של תאי iPS לEBS והתרבות בנוכחות חומצה אסקורבית וסרום, אשר הוכח כדי לשפר את תהליך בידול הלב ולפוsitively להשפיע על ההבשלה של תאים אלה 18,19. במאמר זה אנו נעבור על מתודולוגיה זו בפירוט ונראים כיצד להשתמש בשורות תאי iPS מזין ללא ליצירת מטופל ספציפי CMS IPS-נגזר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ESC-qualified Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &deg;C .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0896-2MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Bio Sera</td>
			<td>XC-S2067/500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, neutral protease, grade II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td>Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (origin South America)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &deg;C, heat-inactivate at 56 &deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA, 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>Make stock at 1% in water, store at -20 &deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &deg;C. Do not keep complete medium at 4 &deg;C for more than 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutristem hESC XF</td>
			<td>Stemgent from Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C O/N, aliquot and store at -20 &deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &deg;C for no more than a week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5853</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dishes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353043</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177380</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3471</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Workstation</td>
			<td>KSystem, by Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

על מנת לחקור את אירועי נהיגה לב ופיתוח כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים המובילים למחלות שריר הלב בבני אדם, זה חיוני ראשון ליצירת cardiomyocytes האנושי מתפקד (CMS). השימוש בתאים אלה בגילוי תרופות ומחקרי רעלים היינו גם להיות מועילים מאוד, המאפשרים מולקולות תרופתיות חדשות לטיפול בהפרעות בלב להיות מאומת טרום קליני בתאים ממקור אנושי. המקורות האפשריים של CMS, המושרה גזע pluripotent (שב&quot;ס) תאים הם בין המבטיח ביותר, כפי שהם יכולים להיגזר מרקמת מטופל נגישה ובעלי יכולת פנימית כדי להצמיח את כל סוגי התאים בגוף 1. מספר שיטות הוצעו להפרדת תאי iPS למערכת ניהול תוכן, הנעות בין גופי embryoid הקלסיים (EBS) גישה לפרוטוקולי צבירת הגדרה כימית 2,3. במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול מבוסס EBS ולהראות איך זה methoיכול להיות מועסק ד כדי לייצר ביעילות תאים דמויי CM פונקציונליים מתאי iPS מזין ללא.

במחקרים שלנו אנחנו נוצרו CMS מכמה שורות תאי iPS. קווים אלו נוצרו בתחילה על שכבת מזין MEF אבל הונחו מייד על Matrigel באמצעות מדיום מוגדר (או mTESR1 או Nutristem). מבחני שונים שמשמשים לאימות תחזוקה של נכסים מורפולוגיים, הביטוי של סמנים אופייניים לתאי pluripotent (OCT-4, וSSEA4 TRA1-60) ויציבות הגנום ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

תאי גזע pluripotent, או גזע pluripotent (שב&quot;ס) תאים עובריים או מושרה, מהווים מקור חשוב של תאים מובחנים אדם, כוללים שריר לב. כאן, אנו נתמקד באינדוקצית לב של תאי iPS, מראים כיצד להשתמש בם כדי להשיג cardiomyocytes האנושי מתפקד באמצעות פרוטוקול המבוסס על גופי embryoid.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K Views.  Humanitas Clinical and Research Center, Italy. תאי גזע pluripotent, או גזע pluripotent (שב"ס) תאים עובריים או מושרה, מהווים מקור חשוב של תאים מובחנים אדם, כוללים שריר לב. כאן, אנו נתמקד באינדוקצית לב של תאי iPS, מראים כיצד להשתמש בם כדי להשיג cardiomyocytes האנושי מתפקד באמצעות פרוטוקול המבוסס על גופי embryoid.

Video: Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.

ייצור ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים שמקורם בשתן

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

אפיון אנטיגנים על פני השטח ויכולת התפשטות ב-MSCs מונעי hiPSC

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

מחבר זרקור: התקדמות בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובמחקר מחלות גנטיות 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...