אנו מודים לד&quot;ר ט אוטיס, המחלקה לנוירוביולוגיה, UCLA, לשיתוף מתקן TPLSM איתנו, ד&quot;ר ג Fahlke, המכון לפיזיולוגיה, RWTH אאכן, גרמניה, על התרומה סוג של pEYFP-ClC1 פלסמיד, ומר . ר סראנו לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH / NIAMS מענקים AR047664 ו AR54816.

הפרוצדורות שכן electroporation vivo של השרירים FDB ו IO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת בפרוטוקולים vivo electroporation, פלסמידים ביטוי יונקים יש ריכוז מוגבר להניב בטווח של עד 2-5 מיקרוגרם הערה פלסמיד / μl של TE:. אנו משתמשים באופן שגרתי ערכות הגברה מסחרית בצע את ההליכים של היצרן. ביטוי מסחרי פלסמידים הנושאים את העבודה האמרגן CMV היטב בשרירי השלד ב transfections vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח Aliquot הצורך (1-20 μl) של הפתרון פלסמיד ולשמור אותו בשתי 0.5 מ&quot;ל Eppendorf צינורות (אחד עבור כל רגל של העכבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה המכילה 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​hyaluronidase ב Tyrode סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתיבת הרדמה, עמוק להרדים בעכבר באמצעות 4% isoflurane ב O2 עם מכונת אושרה גז הרדמה. מניחים את חיה על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) ולשמור על הרדמה באמצעות מסיכת פנים מכרסמים. צג את עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת התבוננות במיקרוסקופ לנתיחה, להזריק 10 μL הפתרון hyaluronidase מתחת לכפות הרגלים של רגל אחת על העכבר בעזרת 1 &quot;מחט ארוכה 33 מד סטרילית. לחדור את העור בנקודה קרוב לעקב כף הרגל ולקדם את מחט תת עורית לעבר בסיס של אצבעות על ~ 1 / 4 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עם הרגל השנייה אם רוצים כל כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את הרדמה במקום עכבר בכלוב. אפשר לו להחלים לחלוטין מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה, להרדים את החיה בפעם השנייה והנח אותו על משטח חימום. בעקבות ההליך אותו תיאר לפתרון hyaluronidase, להזרים סכום של 20-50 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד (תלוי בגודל של לבנות את הפלסמיד). נפח הזרקה בסך הכל צריך להיות פחות מ 20 μL / רגל. הערה: כאשר L μ 15-20 הכרחי, מומלץ לסגור את העור בנקודת הכניסה מחט עם דבק רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את הרדמה במקום עכבר בכלוב. אפשר לו להחלים לחלוטין מן ההרדמה ולחכות 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה בפעם השלישית ולמקם אותו על משטח חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר רגל אחת של החיה. מקום אחד מצופה זהב דיקור מחט מתחת לעור בעקב, ואת השני בבסיס הבהונות. אלקטרודות מקבילים בכיוון אחד את השני בניצב לציר הארוך של כף הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את ראש מחטים (אלקטרודות) כדי ממריץ החשמל באמצעות מיקרו קליפ מחברים. Electroporate את השרירים על ידי החלת פולסים 20, 20 מילישניות משך / כל אחד, בכל 1Hz. בהתאם המרווח של האלקטרודות, משרעת מתח &quot;פולסים מותאם (על ידי ניטור עם אוסצילוסקופ) להניב שדה חשמלי של הערה ~ 100 V / cm:. התכווצויות לא כתגובה לגירויים יש לשים לב אם רמת הרדמה היא נאותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה כך, חזור על התהליך המתואר לעיל ברגל הנגדי של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את החיה לכלוב שלה התאושש לחלוטין מן ההרדמה פעם לשמור את זה תחת השגחה. הערה: אם ההליך המשיך כרגיל, החיה צריכה להחזיר ניידות מלאה בתוך 30 דקות ולאחר מכן הוא מוכן להישלח בחזרה לחדר חיה בבית ביבר. זריקות של hyaluronidase ו-DNA לכפות הרגלים אין תופעות לוואי מורגש על בעלי החיים. התאושש לאחר מההרדמה, עכברים מסוגלים בנחת בדרך כלל סביב הכלוב. כאמצעי זהירות נוסף, להוסיף למי השתייה של Carprofen החיה ב 0.0027 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במשך 2 ימים כמשכך כאבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי חלבון יכול להיות assayed 2-8 ימים לאחר transfection. עם זאת, ביטוי מתמשך של חלבונים רבים נצפתה במשך חודשים. </li></ol> הערה: כל הנהלים חיה אושרו על ידי ועדת הקנצלר של UCLA Animal Research כמו המנדט על ידי חוק לרווחת בעלי חיים ומדיניות PHS על טיפול השתמש ההומאנית של חיות מעבדה. נציג תוצאות: יישום נכון של תהליכי vivo electroporation שתוארו לעיל צריך לגרום transfection יעיל של פלסמידים בשרירים FDB ו Io. עם זאת, היעילות של הביטוי של וריאנטים חלבון מהונדס יהיה תלוי פלסמיד, את גודל ואת המורכבות של החלבון, את המאפיינים תפקודית של חלבון, וכן מספר משתנים אחרים מחוץ לשליטתנו. כמו באיור 1 של שריר FDB electroporated בנוכחות קידוד מסחרי (PMR-mCherry) פלסמיד לחלבון mCherry, רוב סיבי השריר הם transfected עם פרוטוקול שלנו כפי שמודגם על ידי העובדה שרובם להציג פלואורסצנטי אדום. זה אינו פוסל את האפשרות כי סיבים בודדים התערוכה דרגות שונות של ביטוי חלבון, או סיבים מעטים אינם transfected בכלל 3. יש בדואר ציין כי ביטוי יעיל של כמויות גדולות של חלבוני ניאון כגון mCherry, EGFP, ECFP ו EYFP, אינו פוגע רגישות סיבי &quot;עירור שרירים, התכווצות נכסים צימוד. למעשה, הם נבדלים אלה השרירים דמה transfected (תוצאות לא מוצג). גישות מעשיות להשתמש כדי לאמת את ביטוי מקומי של חלבונים fluorescently-tagged בתוך סיבי שריר השלד. לוקליזציה תאיים של חלבונים די נובו מהונדס הביע מוערך באופן שגרתי על ידי רכישת סימולטני, באמצעות, TPLSM תמונות הניאון של התגים ותמונות בהתאמה של סמנים היטב לזהות מבנים הסלולר. הטיפוסי ביותר של אלה האחרונים הם:) שנית הרמוני (SHG) דור תמונות, אשר נובעים אנאיזוטרופיה שרירן sarcomeric של להקות (מרוכז ב-M-lines) 9,10 ו, ב) di-8-ANEPPS פלואורסצנטי תמונות, אשר ניתן להשיג על ידי תיוג את פני השטח רוחבי צינורי (T-אבובית) מערכת הממברנות של סיבי השריר עם dye11 זה פוטנציומטרית impermeant. בתמונות הקרינה של סיבי שריר מוכתם di-8-ANEPPS, T-tubules יופיעו להקות הצר של הקרינה בכיוון מאונך כ על ציר זמן של סיבים. להקות אלו רווח שווה זה מזה: הם מופרדים על ידי מרחק רב אשר משתרע על פני ה-M-שורות קצרה כי משתרע על פני 11 Z-line. הביטוי לוקליזציה של α-actinin-EGFP בתוך סיבי שריר השלד. דוגמה לביטוי של גרסה מתויג של חלבון השריר מבניים α-actinin מוצג באיור 2. חלבון זה נקרא להיות מרכיב מרכזי של קו-Z, וככזה, הוא משמש באופן שגרתי כסמן של structure12 זה. אנו transfected השרירים FDB ו IO עם קידוד pEGFPN1-α-actinin1 פלסמיד עבור (שרירים שאינם) אדם α-actinin מתויג בטרמינל C עם EGFP. שישה ימים לאחר transfection, מצאנו כי, כפי שנבחנו על ידי חלוקת הקרינה EGFP, α-actinin מתבטאת בעיקר להקות צר ברווחים שווים לאורך ציר סיבים. להקה אחת לכל sarcomere נתפסת (איורים 2A &amp; 2D). Colocalization של להקות אלה עם ה-Z קווי מודגם על ידי השוואת התפלגות EGFP פלואורסצנציה עם SHG (תרשים 2B) ו di-8-ANEPPS (2E איור) תמונות. כפי שמוצג על ידי התמונה כיסוי (איור 2C), α-actinin-EGFP להקות חלופי עם להקות SHG, המציין כי הם נמצאים באמצע הדרך בין שני M-להקות ברציפות, בד בבד עם המיקום של Z-הקווים. בתוך סיבי השריר transfected מוכתם di-8-ANEPPS, α-actinin-EGFP להקות נראים מרוכז בין כל זוג של T-tubules (תרשים 2F) אשר ידועים האגף קווי Z (כלומר מופרדים על ידי מרחק קצר), וכך המציין כי מהונדס α-actinin מיועד קו-Z. הביטוי של DHPRα1s מתויג בתחנה הסופית-N עם EGFP היעילות של transfection שריר עם pEGFPC1.1 DHPR α-1s מאומת בתמונות TPLSM (למשל איור 3A) מראה כי רוב הסיבים להביע EGFP-DHPRα1s (חלבון הטרנסממברני). התכונה הבולטת ביותר של סיבים transfected הוא דפוס פעמיים חברו של EGFP פלואורסצנטי (איורים 3A &amp; 3B) כפי שניתן היה לצפות, אם זה היה ממוקד חלבון ה-T tubules. זה יכול להיות גם ציין באיור 3 כי בעוד סיבים שונים להציג רמות שונות של עוצמת הקרינה, את דפוס הקרינה התאגדו של סיבים בודדים נראה להישמר הומוגנית לאורך הסיב. בהגדלה גבוהה יותר (איור 3 ב), ניתן לראות בבירור כי ריווח אחיד בין להקות דומה לזה שנצפה סיבים מוכתם di-8-ANEPPS (למשל 2E איור). התמונות כיסוי (איור 3B &amp; 3E) להמחיש כי להקות SHG נמצאים בתוך המרווח הגדול בין EGFP-DHPRα1s להקות, אישרו כי החלבון הזה ב-T-tubules. מדידות נוספות סריג עם אניון לא פלורסנט lipophilic-DPA (מידע לא מוצג) נוספים מראים כי מחצית EGFP בתוך ננומטרים ספורים של העלון הפנימי של קרום של T-tubules. לוקליזציה והערכה תפקודית של הביטוי של EYFP-ClC1 סיבים transfected עם pEYFP-ClC1, המקודד לבנות EYFP-tagged (ב-N טרמינל) של ערוץ כלוריד שרירי השלד (ClC1), להציג EYFP להקות פלואורסצנטי (איור 4A) עם דפוס דומה לזה שנצפה עבור EGFP-DHPRα1s &quot;הביטוי (איור 3A) ו המקביל להסדר T-אבובית כמו מאויר עם מכתים di-8-ANEPPS (2E איור). כצפוי, אימפוזיציה של EYFP-ClC1 (איור 4A) ותמונות SHG (איור 4B) כפי שמוצג כיסוי (איור 4C), ממחישות כי להקות SHG מרוכזים על ריווח גדול of בין להקות EYFP פלואורסצנטי. על מנת להעריך האם הבעת EYFP-ClC1 תוצאות לעלייה משמעותית מוליכות המנוחה של סיבי השריר, כצפוי מ overexpression של תעלות כלוריד פונקציונלי, אנו סיבי השריר enzymatically ניתק מן השריר FDB transfected ולמד תכונות אלקטרו שלהם באמצעות שתי microelectrodes ההתקנה הניסוי שתואר לעיל 6,11,13. איור 5 מציג תוצאות משני סיבים: אחד להביע את כמויות גדולות של EYFP-ClC1 כפי שהוערכו מן העולמי מדידות עוצמת הקרינה מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל (לא מוצג), והשני הוא פקד שאינו transfected. שיא המתח באיור 5A (המתקבל סיבי השריר להביע EYFP-ClC1) מוכיח כי בשל מוליכות המנוחה מוגזם, סיבים הוא כמעט ולא להתרגש. פולסים גירוי מקומי של עד 400nA (0.5ms) צריך לשמש כדי לעורר תגובה פעיל מאוד קטנה (לא, להחטיא את המטרה 5A איור). לאחר החלפת הפתרון Tyrode חיצוני אחד המכיל 500 מיקרומטר של חוסם כלוריד ערוץ 9-ACA, 200 פעימות NA הנוכחית הספיקו כדי לעורר פוטנציאל פעולה (איור 5 ב), אם כי איטי יותר ורחב יותר מאלו שנרשמו סיבים הביקורת ( איור 5 ג). כצפוי, תוספת של 9-ACA הייתה השפעה מינימלית על סיבים שליטה זו (איור 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /> באיור 1. Transfection היעילות של השיטה ב-vivo electroporation. Brightfield (א) ו פלואורסצנטי (ב &#39;) תמונות של שריר FDB transfected עם mCherry-PMR. ימים לאחר פרוטוקול electroporation: 12 ימים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הביטוי המיקוד של α-actinin-EGFP בסיבים FDB. פאנלים A ו-B הם פלואורסצנציה EGFP ותמונות SHG, בהתאמה, של סיבי להביע α-actinin-EGFP. לוח C הוא סופרפוזיציה של התמונות ב A ו B. פאנלים D ו-E הם תמונות פלואורסצנציה של סיבים אחרת להביע α-actinin-EGFP ומוכתמת עם di-8-ANEPPS, בהתאמה. לוח F היא סופרפוזיציה של תמונות D ו E. ימים לאחר electroporation פרוטוקול: 6 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הביטוי המיקוד של EGFP-DHPRα1s בסיבים FDB. לוח א &#39;, תמונה EGFP הקרינה של קבוצת סיבים להביע EGFP-DHPRα1s. לוח ב &#39;הוא הגדלה של הריבוע בלוח כדי להראות טוב יותר את הדפוס התאגדו ביטוי החלבון. לוח C הוא דמות SHG המתאימים לדימוי בלוח לוח א D הוא כיסוי של תמונות ו-C פאנל E הוא הגדלה של אזור המצוין ימים פאנל ד לאחר פרוטוקול electroporation: 20 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הביטוי המיקוד של EYFP-ClC1 בסיבים FDB. לוחות A ו-B הם פלואורסצנציה EYFP ותמונות SHG, בהתאמה, של סיבי להביע EYFP-ClC1. לוח C הוא סופרפוזיציה של התמונות לוחות A ו-B פאנל D הוא פרופיל העוצמה נמדדת לאורך קו לבן מסומן בתמונה בימים פאנל C. לאחר פרוטוקול electroporation: 7 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. סיבים אלקטרו להביע הערכה מהונדס EYFP-ClC1. פאנלים A ו-B הן רשומות מתח מ סיבים להביע EYFP-ClC1 בתגובה פולסים הנוכחית לפני ואחרי הטיפול עם 9-ACA, בהתאמה. לוחות C ו-D רשומות מתח (פוטנציאל פעולה) שהושרו בתגובה פולסים הנוכחית סיבים שאינם transfected לפני ואחרי הטיפול עם 9-ACA, בהתאמה.

<ol>
	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו מתארים כאן את הצעדים מפורט כי יש לפעול כדי להשיג transfections יעיל של פלסמידים DNA לתוך סיבי שריר השלד על ידי electroporation ב vivo. היתרונות העיקריים של הגישה שלנו הן את הפשטות של היישום, הפולשנות שלו מינימלית שתוצאתה סיכון בריאותי זניח לבעלי החיים. במציאות, פרוטוקולים מעל ...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

עניין גובר בביולוגיה של התא היא להביע צורות transgenically שונה של חלבונים חיוניים (למשל בונה מתויג fluorescently ו / או וריאנטים מוטנטיים) על מנת לחקור הפצה אנדוגניים שלהם ואת הרלוונטיות תפקודית. גישה מעניינת כי יושם להגשים מטרה זו בתאים הבדיל באופן מלא הוא<em&gt; In vivo</em&gt; Transfection של פלסמידים על ידי שיטות שונות לתוך רקמות ספציפיות כגון הכבד<sup&gt; 1</sup&gt;, שרירי השלד<sup&gt; 2,3</sup&gt;, וגם את המוח<sup&gt; 4</sup&gt;. אנו מציגים כאן תיאור מפורט של הצעדים שיש אחריו על מנת ביעילות transfect החומר הגנטי לתוך סיבי של<em&gt; Flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB) ו<em&gt; Interosseus</em&gt; (IO) בשרירים של עכברים מבוגרים באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; גישה electroporation. הפרמטרים ניסיוני מוטבו כדי למקסם את מספר סיבי השריר transfected תוך מזעור הנזק לרקמות שעשוי לפגום באיכות וכמות החלבונים המתבטאת סיבים בודדים. יש לנו אומת כי יישום המתודולוגיה המתוארת במאמר זה תוצאות תשואה גבוהה של חלבונים מסיסים, כלומר EGFP ו ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, וכו &#39;; חלבונים מבניים, כלומר minidystrophin ו α-actinin וכן חלבונים בממברנה, כלומר α1s-DHPR, RyR1, לב Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; מחליף, NaV1.4 Na הערוץ, SERCA1 וכו &#39;, כשהם מיושמים FDB, IO ושרירים אחרים של עכברים וחולדות. הביטוי יעיל של כמה חלבונים אלה אומת עם ביוכימיים<sup&gt; 3</sup&gt; ופונקציונלי ראיות<sup&gt; 5</sup&gt;. עם זאת, ספק גישה מאשרות הנפוצים ביותר בשימוש על ידי מאיתנו מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל 2-פוטון מיקרוסקופית סריקת לייזר (TPLSM), המאפשרים לזהות לא רק את הביטוי הכללי, אלא גם לוקליזציה תאיים מפורט, של החלבון בונה מתויג fluorescently. השיטה יכולה לשמש באותה מידה transfect פלסמידים קידוד לביטוי של חלבונים הרלוונטיות פיזיולוגיים (כפי שמוצג כאן), או התערבות RNA (siRNA) במטרה לדכא את הביטוי של חלבונים הביעו בדרך כלל (לא נבדק על ידינו עדיין). יצוין כי transfection של סיבי שריר FDB ו IO רלוונטי במיוחד עבור חקירת הפיזיולוגיה שריר יונקים מאז סיבי enzymatically ניתק מן השרירים הללו כיום אחד הדגמים הכי מתאים לחקור את המנגנונים הבסיסיים של צימוד עירור רגישות ו-התכווצות תחת מהדק התנאים הנוכחיים או מתח<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

אנו מתארים נהלים מפורטים transfection היעילה של DNA פלסמיד לתוך הסיבים של שרירי כף הרגל של עכברים חיים באמצעות electroporation ואת להדמיה הבאות של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

17.7K Views.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. אנו מתארים נהלים מפורטים transfection היעילה של DNA פלסמיד לתוך הסיבים של שרירי כף הרגל של עכברים חיים באמצעות electroporation ואת להדמיה הבאות של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Video: DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.