ניתוח הניקוד השיטתי הוא טכניקה להערכת פגיעה ריר, להקל על פרשנות היסטולוגית שיכולה להתבצע על ידי חוקרים מיומנים. היתרונות העיקריים של שיטה זו היא שהיא חופשית וקלה לשימוש. זה מאפשר ניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים המתקבלים מהמעיים של עכברים עם קוליטיס.
פרוטוקול זה מספק דרך מהירה וניתן לשחזור לפרש את חומרת המחלה של המעי הגס כולו, אשר הכרחי להשוואת מחלות מבעלי חיים מרקעים גנטיים שונים. להכנת רקמות, חשוב לארגן את כל ריאגנטים וחומרים. התחל על ידי הנחת עכבר מורדם על כרית מנתח בתנוחה סופית לשתק את גפי העכבר באמצעות 20 מד 1.5 מחטים אינץ '.
באמצעות מלקחיים ומספריים, לעשות חתך קטן על עור הבטן ולמשוך אותו לצד כדי לחשוף את הצפק, ואז לפתוח את חלל הבטן עם חתך קו האמצע בצפק מעצם הערווה לצדדים של הבטן. בזהירות להסיר רקמות ואיברים עד המעי הגס הוא דמיון. חותכים את עצם האגן משני צידי המעי הגס כדי לדמיין באופן מלא את האיבר, המשתרע מפי הטבעת לכיוון cecum.
בעדינות להסיר שומן, ורידים קטנים, ועורקים המחוברים המעי הגס תוך ניתוח זהיר של האיבר, חיתוך רק קרוב לפי הטבעת ו distal כדי cecum. בזהירות לשטוף את המעי הגס עם PBS כדי להסיר תוכן צואה באמצעות מחט gavage פלסטיק גמיש מוכנס דרך פי הטבעת. מקמו את המעי הגס בקו ישר ופתחו לאורך העורק המזנטרי.
חוצה את המעי הגס לאורך זמן מהדיסטלי לקצה הפרוקסימלי. השתמש במחצית הרקמה לניתוח היסטולוגי ואת החצי השני עבור כתם מערבי, PCR, או התגלגל לתוך גליל שוויצרי שני עבור מיקרוסקופיה קפואה טרי. לקצץ רקמה נוספת מן המעי הגס proximal עם סכין גילוח עד בערך באותו רוחב לאורך המעי הגס כולו מתקבל.
ליישר את המעי הגס כדי לחשוף את לומן לשטח את הרקמה לחלוטין באמצעות מחט gavage גמיש. הוסף עוד PBS במידת הצורך כדי לשמור על הרקמה לחה לאורך כל ההליך. הסר את PBS העודף באמצעות ניגוב נייר.
עם מזרק ומחט gavage, להוסיף 10% ניטרלי אגירה פורמלין פתרון במשך שתיים עד שלוש דקות כדי לתקן ולשטח את הרקמה, ולאחר מכן להשתמש במלקחיים ישרים לתפוס את הקצה של המעי הגס דיסטלי ולסובב את המעי הגס לתוך מעגלים קונצנטריים מן הדיסטלי לקצה proximal. הכנס מחט 27 מד להצמיד את המעי הגס באמצע ולהחזיק את צורת הגליל השוויצרי שלה, ולאחר מכן למקם את הגליל השוויצרי לתוך קלטת הטבעה בתוך מיכל דגימה היסטולוגית מכוון את הרקמה במקביל לקלטת. לתקן את הרקמה בתמיסת פורמלין אגירה ניטרלית 10% לילה בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר קיבוע לילה, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם PBS. מוסיפים 70% אתנול לפני תהליך הטמעת הפרפין ומסירים את המחט מהגליל השוויצרי לפני שתמשיך. הרקמה יכולה להיות מאוחסנת באתנול בטמפרטורת החדר עד הטבעה פרפין.
לאחר פתיחת התמונות הסרוקות בתוכנת עיבוד התמונה, ודא שהמעי הגס כולו גלוי ושאם אין אזורים חסרים במדגם. הפעל את ה Imager של התווית ואת כלי סרגל קנה המידה כדי לזהות כראוי שקופיות סרוקות על-ידי לחיצה על Imager תווית. פתח את כלי הביאורים על ידי לחיצה על ביאורים וליצור שלוש שכבות שונות על ידי לחיצה על שכבה חדשה כדי לכמת את האורך הכולל של רול שוויצרי, דלקת או פציעה, שחיקה או כיב.
בחרו צבע אחר לכל שכבה בלחיצה על צבע השכבה. מדוד את אורך כל שכבה או קטגוריה על-ידי לחיצה על הכלי עט כדי למתוח קו בעקבות רירית השרירים, והזז את המצביע לפי הצורך כדי להמחיש את האזור הסמוך לניתוח. הצג את התמונה בזום של 400 מיקרומטר כדי להקל על הדמיה נאותה של רירית השרירים.
בכל פעם שהעט יופסק, ייווצר אזור שכבה חדש וקטן. ניתן להמחיש ולערוך אותו באמצעות הכרטיסיה 'אזורי שכבה'. סקור את האורך הכולל, דלקת או פציעה, ושחיקה או כיב נמדד באמצעות רירית השרירים כנקודת התייחסות.
לאחר הגדרת כל השכבות, ייצאו את הנתונים באמצעות רשת הייצוא ללחצן קובץ מלל בתוך אפשרויות אזורי השכבה. פתח את קבצי הטקסט והעתק את הנתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני. סה"כ את כל המקטעים מכל אזור וחשב את אחוז הפציעה והכיב ביחס לאורך הכולל.
שקול שלושה מאפיינים עיקריים כדי לחשב את הציון קוליטיס היסטולוגית כדי להעריך את חומרת המחלה. בדוק רירית מעיים בריאה, המאופיינת בתאי אפיתל מאורגנים בציר הקריפטה הזוהר, למינה פרופריה עם מעט תאי חיסון ורירית שרירים תת-קרקעית. לאחר מכן, בדוק דלקת או פציעה, המאופיינת בקריפטות אפיתל מוחלשים או חסרים חלקית בתאי אפיתל ודלקת ריר עם חדירת נויטרופילים לקריפטות.
לבסוף, בדוק את נוכחותם של שחיקה או כיב, אשר מאופיין באזורים נטולי אפיתל פני השטח או אזורים חסרים לחלוטין קריפטות אפיתל עם או בלי לויקוציטים הקשורים. כדי להמחיש את האמינות של ניתוח ניקוד קוליטיס היסטולוגי זה בהקשר של נזק ריר, 2.5%DSS היה מנוהל במי השתייה של שמונה עכברים מסוג C57BL6 פראי במשך חמישה ימים, ואחריו תקופת התאוששות עם מים רגילים במשך חמישה ימים. משקל הגוף נשאר קבוע במהלך הממשל החריף של DSS, אבל ירד באופן דרמטי כאשר עכברים התחילו לשתות מי ברז רגילים.
דם ושרפרפים רכים הופיעו לאחר שלושה ימים של ניהול DSS ונמשכו עד היום השמיני של הניסוי. תצפיות אלה הראו כי ההשפעות המזיקות ביותר של חשיפה DSS נצפו במהלך תקופת ההחלמה בין ימים חמש לשמונה. מדידת אורך המעי הגס ביום 10 אישרה קיצור משמעותי בסוף הניסוי.
המעי הגס נקצרו ביום אפס, שתיים, חמש, שבע, שמונה, ו -10 כדי להפוך לחמניות שוויצרי פרפין. הרקמה הוכתמה ב- H& סריקות בחדות גבוהה נותחו כדי לחשב את ציון הקוליטיס ההיסטולוגית ואת אחוז הפציעה וכיב. ארכיטקטורת קריפטה רגילה נצפתה בעכברים לא מטופלים.
לאחר יומיים של ניהול DSS, גיוס תאים חיסוניים נצפתה. ביום החמישי, תאי אפיתל מופיעים פגומים והייתה חדירה של נויטרופילים על פני האפיתל הקשורים לפגיעה אפיתל. מהיום החמישי עד שמונה, אזורים של אובדן אפיתל עם דלקת וכיב נצפו.
ביום העשירי, תאי אפיתל החלו להתחדש ולאכלס מחדש אזורים כיביים, תוך שחזור איטי של רירית המעי הגס. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב ליצור גליל שוויצרי מכוון היטב שמור היטב, כמו גם לזהות כראוי דלקת הרירית או פציעה וכיב או שחיקה. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך כמותית פציעה לאורך כל רירית המעי הגס במודלים אחרים של קוליטיס, כגון TMS או T-cell העברת מודל.
