שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום biodisease דלקתי על קוליטיס כיבית ומחלת קרוהן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להעריך את ההשפעות הראשונות נגד ו proinfammatory של חלבוני איתות. המשמעות של טכניקה זו מרחיבה את סקר הגז בהתקדמות חדשה ודלקת.
למרות שיטה זו יכולה לספק תובנות על השפעה גנטית על דלקת במעיים. זה יכול להיות מיושם גם על גורמים אחרים כגון דיאטות ומיקרוביום. בדרך כלל, אנשים חדשים בסמסטר זה יתקשו כי עיבוד רקמת צלקת המחלה הוא מסובך.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו ניתוח ואת צעדי הכנת הרקמה קשה ללמוד כי mystalia ומבני רקמת התא עשוי להשתנות. כדי לגרום לנתרן דקסטרן סולפט, או קוליטיס DDS, להחליף את מי השתייה הרגילים עם 3% פתרון DSS, להוסיף ליבידיום במשך שבעה ימים. מדידת משקל הגוף של כל עכבר, צריכת פתרון DSS וייצור צואה מדי יום.
בסוף הטיפול בן שבעת הימים, מניחים את העכבר בתצב האופין ומשתמשים במספריים קטנים כדי לבצע חתך קו אמצע באורך שלושה סנטימטרים בבטן. לקצור את הטחול ולמדוד את גודלו. ואז להשתמש במטסים כדי להרים את המעי הגס כדי לאפשר לו להיות מופרד מן mesentery שמסביב.
ולחלץ את המעי הגס כולו עד cecum ופי הטבעת גלויים. תעביר את הרקמה בשולי הקולומוסקל. ועמוק בתוך האגן כדי לשחרר את המעי הגס הפרוקסימלי והדיסטלי, בהתאמה.
למדוד ולתקליט את אורך המעי הגס המבודד. ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד במחט gavage לשטוף את המעי הגס עם 10 מיליליטר של קרח קר PBS כדי להסיר את הצואה והדם עד ההתגלמות פועל ברור. לזיהוי היסטולוגי, חלקו את דגימות הרקמה לחלקים פרוקסימליים, אמצעיים ודיסטליים בגודל שווה.
ולתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde לילה ב 4 מעלות צלזיוס. עבור הכתמת המטוקסילין ואאוסין של רקמת המעי הגס מבודדת, למחרת בבוקר, להטביע את חתיכות הרקמה ב 30% סוכרוז ו PBS לילה בצינורות בודדים 15 מיליליטר להגנה קריו של הדגימות. למחרת, להטמיע את הרקמות בטמפרטורת חיתוך אופטימלית או תרכובת OCT.
ומצננים את הרקמות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שה-OCT מתקשה. מניחים את בלוקי OCT ב cryostat ולהגדיר את עובי לחייג 12 מיקרומטר. לאחר מכן לחתוך ולאסוף 12 חלקים קפואים עבים מיקרומטר על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית.
כאשר כל הרקמות כבר חתוכו, לחמם את המגלשות ב 65 מעלות צלזיוס על צלחת חמה במשך 20 דקות. ולשטוף את החלקים המחוממים לזמן קצר במים מזוקקים לפני הכתמה עם תווי מכתים המטוקסילין במשך חמש דקות. הסר את תווי המטוקסילין העודפים ורוץ במי ברז במשך חמש דקות.
ולהבדיל את החלקים עם 0.5% חומצה הידרוכלורית באתנול במשך 30 שניות, ואחריו שטיפה של דקה אחת תחת מי ברז זורמים. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות במשך דקה אחת PBS. ואחריו עוד חמש דקות לשטוף תחת מי ברז זורמים.
בסוף הכביסה, להטביע את הרקמות בסדרת אתנול עולה במשך 10 שניות לטבילה. ואחריו נגד אאוסין במשך שתי דקות. להתייבשות הדגימות, להטביע את השקופיות ב 95%אתנול ושני שינויים של 100%אתנול במשך חמש דקות לטבילה.
ואחריו ניקוי עם שניים, חמישה שינויים דקות קסילן. לאחר מכן ציון הנזק לרקמות המעי הגס הפרוקסימלי, האמצעי והדיסטלי של כל קבוצת ניסוי. לניתוח אימונוהיסטוכימי, לאחר חימום החלקים במשך 20 דקות על הצלחת החמה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף.
ולחסל את peroxidase אנדוגני עם 10 דקות 3%מי חמצן דגירה. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBS כפי שהודגם ולחסום כל כריכה לא ספציפית עם חיץ חסימה לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את חיץ החסימה עם קוקטייל הנוגדנים העיקרי של עניין.
עבור דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, שאפו את פתרון הנוגדנים הראשוני העודף ושטפו את המגלשות שלוש פעמים ב-PBS. לאחר הכביסה האחרונה, הדגירה את המגלשות עם קוקטייל נוגדנים משני biotinylated המתאים.
ואחריו תיוג עם סטרפטבידין חזרת peroxidase קומפלקס בטמפרטורת החדר. כדי להמחיש את התאים החיסונים, סמן את הדגימות ב- DAB עד להתפתחות צבע חום בהיר או כהה. ונגד את החלקים עם המטוקסילין ו 0.3% אמוניה מדוללת.
כאשר השקופיות התייבשו, השתמש במיקרוסקופ אור כדי להשיג תמונות שדה בהירות של מקטעי הרקמה תחת הגדלה של פי 10. ולהשתמש בתוכנית עיבוד תמונה כדי לזהות ולמת את האוכלוסייה של תאי החיסון המסומנים הן אפיתל ואת פרופריה למינה. עבור ניתוח ביטוי גנים במעי הגס שטופלו DSS, לחלץ RNA ממינוס 80 מעלות צלזיוס מופשר דגימות רקמה המעי הגס על פי פרוטוקולי מיצוי RNA סטנדרטיים.
ומערבבים מיקרוגרם אחד עם RNA הכולל עם 2.5 microliters של 20 מילימולר אוליגו deoxythymidine 12 עד 18 פריימרים אחד microliter של מולוני מורין לוקמיה וירוס להפוך transcriptase. לאחר דגירה של 60 דקות ב 42 מעלות צלזיוס, מערבבים מיקרוליטר אחד של cDNA עם 0.5% microliters של פריימרים PCR כמותיים המתאימים קדימה ואחורה עבור ציטוקינים של עניין וצבע ירוק פלואורסצנטי 2x. לאחר מכן הפעל את ה- PCR הכמותי תחת הפרמטרים המתאימים וחשב את ביטוי הגנים היחסי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
בהשוואה לעכברי wildtype, עכברי נוקאאוט אלפא גוסטדוצין להפגין קוליטיס חמורה יותר עם ירידה במשקל מוגזמת, שלשולים ודימום מעיים. לאחר שבעה ימים של ממשל DSS, ניתוח היסטולוגי של חלקי המעי הגס חושף נזק חמור יותר לרקמות בתוך המעי הגס הפרוקסימלי, האמצעי והדיסטלי של עכברי הנוקאאוט, בהשוואה לעמיתיהם הפראיים. הפעלה חיסונית מוגזמת זו מובילה אינדוקציה של קוליטיס עם חדירה חזקה של תאים דלקתיים שונים במעי הגס של בעלי חיים נוקאאוט כפי שנצפה על ידי ניתוח אימונוהיסטוכימי.
יתר על כן, ניתוח PCR כמותי מדגים רמות גבוהות יותר של ביטוי אלפא TNF וגמא תופת אך ביטוי נמוך יותר של IL-5, 10 ו- 13, בנוקאאוט בהשוואה למעי הגס של עכבר wildtype ללא הבדל בביטוי TGF beta אחד שנצפה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייעל את המינון של נתרן southvater textorous ומשך ההדגמה. העברת הליך זה, שיטה אחרת כמו קבלת תרבות יכולה להתבצע על מנת להבין שאלות נוספות כמו ההשפעה של דלקת במקור רקמת המעי.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סוללת דרך לחוקרים בתחום דלקת המעיים לחקור את התרומות של מוטציות גנים לחומרת השחיקה הביודיזיאזית ובריונות אחרות. אל תשכח כי עבודה עם רקמת המעיים המחלה ותכולתו יכול להיות מסוכן מאוד ואת ההשלכות כגון ללבוש דברים מתאימים, הגנה אישית קבוע תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
