כאן אנו מציגים פרוטוקולים משופרים להכנת דגימות קריו-EM עם סרטי תמיכה באמצעות בלוק ציפה חדשני המאפשר טיפול בסרטים עדינים כאלה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי המדגם מוגן מפני ממשק מי האוויר שבו השפעות מזיקות כמו denaturation יכול להתרחש. אחד הפרוטוקולים המוצגים כאן נמנע מכל סוג של טיפול יקר כדי להפוך גרף הידרופילי, ולכן להגדיל את הנגישות שלה לכל קהילת EM.
התקני ציפה קטנים עדיין לא נמצאים בשימוש נרחב על ידי מיקרוסקופיה אלקטרו להכנה טובה. אז הדגמות חזותיות אלה יכולות לספק אמת מידה לשימוש בהם. כדי להתחיל, לשטוף את רשתות TEM עם מים מזוקקים כפול ואתל אצטט ואחריו ניקוי פלזמה.
לאחר מכן להוסיף 10 עד 12 microliters של המדגם לתוך חילופי המאגר היטב, בלוק הציפה ו 10 עד 12 microliters של 2%תמיסת אצטט משתנה לתוך הבאר הסמוכה ללא חוצץ להחליף כתמים שליליים. זה חיוני לנקוט אמצעי זהירות מתאימים בעת עבודה עם כתם. תחתוך בזהירות שתי חתיכות קטנות של נציץ עם סרט פחמן מראש על גבי.
ודא כי שברי הנציץ רחבים מספיק כדי להתאים לבאר וארוך יותר מאורך הבאר, כך שבר יכול לשבת על הבאר בזמן הפחמן צף ויש מספיק מקום כדי להתמודד עם השבר עם פינצטה. לטבול את הנציץ לתוך הבאר עם זווית משוערת של 45 מעלות עד הנציץ יושב על הרמפה של הבאר ואת שכבת הפחמן הוא ציין על פני השטח של מדגם הנוזל. לאחר דגירה של הפחמן עם מדגם, למשוך את גיליון נציץ לאט מאוד כדי לשחזר את סרט הפחמן כדי למזער את שימור מדגם ויסקוס שיורית.
בזהירות כתם את הנציץ על ידי הקשה על משטח נמוך יותר שאינו פחמן עם נייר מסנן כדי להסיר את הנוזל העודף ולטבול את שבר נציץ לתוך הבאר היריבה המכילה 2%תמיסת אצטט משתנה להחליף את שכבת הפחמן עם הכתם השלילי. לשחזר את שכבת הפחמן הצפה עם הצד הפחמן הקדוש מכוסה של רשת EM שטוף ופלזמה ניקה. לאחר מכן להשאיר את הרשתות לאוויר יבש עד הדמיה על TEM, רצוי לכסות אותם כדי למנוע זיהום באוויר.
לאחר ניקוי רשתות TEM כפי שהודגם בעבר, להכין את השעיית תחמוצת גרפן רק לפני השימוש מערבולת ביסודיות. לאחר מכן להוסיף 10 עד 12 microliters של השעיית תחמוצת גרפן לתוך ארבע בארות חילופי חיץ. לאורך בלוק הציפה.
הוסף 10 עד 12 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים או מים טהורים במיוחד לארבע בארות חילופי המאגרים הנותרות של הבלוק. זרוק ארבע רשתות בעדינות על השעיית תחמוצת גרפן של כל באר ודגר במשך דקה אחת כדי להבטיח כי הצד הקדוש מכוסה פחמן הוא במגע עם הפתרון. לאחר דקה אחת, לשחזר כל רשת בזהירות על ידי הזזת פינצטה לתוך חריץ פינצטה של כל חילופי חיץ לא מאגר היטב.
דוחף בעדינות ובקצרה את הצד המכוסה בנחושת שאינו מכוסה בפחמן של כל רשת עם המים המזוקקים הכפולים בבאר הסמוכה עד שטיפת המים נראית ברשת. לאחר מכן החזק בזהירות את טיפת מי הרשת הפוכה כנגד פיסת נייר סינון. מכסים את הרשתות ומשאירים אותם בפינצטה לאוויר יבש.
מניחים ארבע רשתות כביסה על גבי גיליון גרף נחושת המופקד על שקופית זכוכית, ומכסים כל רשת בטיפת איזופרופנול כדי לאפשר מגע אינטימי בין גרפן המונו-שכבתי לבין הרשת. לאחר האידוי המלא של איזופרופנול, לצוף גיליון גרפן נחושת עם רשתות על פתרון כלוריד ברזל בצלחת פטרי זכוכית. לאחר מכן לכסות את המנה כדי למנוע זיהום מוטס ולהשאיר אותו לחרוט בטמפרטורת החדר לילה.
השתמש בלולאה עם הקוטר הגדול מגודל רשת TEM כדי לדוג את הרשתות הצפות על המולייה גרפן ולהעביר אותם בזהירות לצלחת פטרי המכילה מים מזוקקים כפולים לשטיפה. לשטוף את הרשתות פעמיים במים ולהעביר את הרשתות לתוך צלחת פטרי המכילה חוצץ מדגם עד הכנה מדגם לצלול הקפאה. הוסף 10 עד 12 מיקרוליטרים של המדגם לבאר של בלוק הציפה.
כאשר המדגם מוכן בבלוק, בחר את הרשת מצופה גרפן מפתרון המאגר באמצעות זוג פינצטה נקייה ומניחים אותו על פני השטח של המדגם המכיל היטב. לאחר תקופת דגירה מתאימה, להרים את הרשת עם זוג פינצטה הקפאה נקי ולהמשיך עם סופג וvitrification. רשתות מוכתמות שליליות שהוכנו עם בלוק הנפקת התמיכה מכוסות בדרך כלל בפחמן אמורפי על פני הרשת כולה.
בעוד שבירה של סרט הפחמן מתרחשת במקרים מסוימים, מספר רב של ריבועי רשת הם טהורים ולכן ישים למטרות כתמים שליליים. באופן דומה, כיסוי סרט טוב מושגת באופן שגרתי על פני הרשת כולה באמצעות פרוטוקול תחמוצת גרפן. רשתות תחמוצת גרפן ניתן להכין במהירות מחומרי גלם והם מגנים מאוד על המדגם.
שמירה על גרפן רטוב ויישום מדגם במקום ממש לפני ההקפאה מספיק כדי ליצור שכבות קרח מתאימות עבור cryo-EM. פרוטוקול זה אינו דורש ציוד כדי להפוך את גרפן הידרופילי ומספק יתרון עבור שחזור מדגם. בלוק הנפקת התמיכה יש שתי יציאות מחט באתר של כל באר המאפשרות להאריך מאגר ב- C2 וזה מאוד שימושי עבור דגימות נגזר מעברי צבע גליצל.
בלוק הציפה אפשר לחקור שיטות טיהור זיקה ברשת על ידי שימוש בזרימת מאגר לשליטה של כרכים קטנים, כמו גם סרטי תמיכה פונקציונליים.
