Name: an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

כל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית קרן המחקר של סינסינטי הילדים. לצורך המחקר, בתאי גזע hematopoietic בודדו ממח העצם של עכברים מולדים C57Bl / 6 בגילים 2 - 4 חודשים. מיון תאים באמצעות FACS לאחר צביעה של BM עם מקבלי משטח שונים כולל Lineage, c-Kit, SCA-1, FLT3 ו- CD34 שימש לטיהור HSC מבוסס על Lin- SCA-1 + c-kit + FLT3 - CD34 - gating אסטרטגיה כמו פרוטוקול סטנדרטי תיאר לפני 8. זהירות: כימיקלים רעילים מספר מאוד משמשים במהלך הליך זה. אלו הם רעילים משאיפת ומגע עור. יש ללבוש כפפות וביגוד מגן. לעבוד במנדף תוך כדי עבודה עם כימיקלים אלה. 1. תאים, קיבוע, מכתים טרום הטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין 10,000 בתאי גזע hematopoietic (באמצעות לין - SCA-1 <sup&gt; + c-kit + FLT3 - CD34 - gating האסטרטגיה; LT-HSC אוכלוסייה) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 600 μl השונה של Iscove הבינוני של Dulbecco (IMDM) עם 10% בסרום שור עוברי באמצעות FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה HSCs מיון XG ב 1000 במשך 10 דקות בתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge באמצעות צנטריפוגות עם דליים התנופה-אאוט. הסר בינוני על ידי שאיפה עדינה ולהשאיר 200 בינוני μl של צינורות בכל שלב. בשלב זה, התא הגלול אינו נראה בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 0.2 מ&quot;ל של תמיסת מקבע 2x בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעה 1 1,9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרון מקבע טרי לפני השימוש. בשעה 1x, הפתרון מורכב glutaraldehyde paraformaldehyde 3% ו -2.5% במאגר M 0.1 cacodylate. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות עם דליים-אאוט התנופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylateבאמצעות צנטריפוגה ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים קבוע על ידי הוספת 200 μl של 2 פתרון מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של כחול אוונס במאגר cacodylate דגירה במשך 20 דקות ב RT. התא יהיה בצבע כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף התאים 3 פעמים עם 600 μl של 0.1 מ &#39;צנטריפוגה באמצעות חיץ cacodylate ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התאים 200 חיץ μl ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 0.5 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. הסר חוצץ בעדינות מבלי להפריע גלולה תא זעיר נראה כעת, ולהשאיר חיץ 50 μl בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 מ&quot;ג התכה נמוכה agarose עד 5 מ&quot;ל של 0.1 M חיץ cacodylate בצינור 15 מ&quot;ל פתרון agarose 4%. ממיסים את agarose על ידי העברת צינור למים רותחים בתוך בקבוק זכוכית 100 מ&quot;ל ולשמור פושרים עד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 4% התכה נמוכה מומס agarose ב 0.1 M cacodylate חיץ ההשעיה תא צינור 0.5 מ&quot;ל ומיד צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אישור תאים pelleted בתחתית הצינור 0.5 מ&quot;ל לתוך agarose חצי מוצק לאחר צנטריפוגה, מיד להעביר את הצינור עד 4 מעלות צלזיוס או קרח למשך 20 דקות כדי לחזק את agarose. שלב זה הוא קריטי מאוד, כמו תא גלול גלוי קטן תוצאות שלב זה מקבץ טוב של תאים מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה מהצינור על צלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ פטרי המכילה חיץ באמצעות 3,10 מחט 27 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה לתוך חתיכה אחת של כ 1 - 2 מ&quot;מ עם אזמל. מעבירים את פיסת agarose המכיל גלולה לתא צינור 1.5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 - 3 פעמים באמצעות 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylate ידי הוספה והסרה של חיץ באמצעות פיפטה ללא צנטריפוגה. השתמש חתיכת agarose זה המכיל את התא גלול עבור לשלב הבא. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני המעבר לשלב הבא. </li></ol> 2. Osmification, התייבשות, והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ cacodylate מהצינור 1.5 מ&quot;ל עם תא גלולה המכילה באמצעות agarose טפטפת. להוסיף 1.0 מ&quot;ל של 1% אוסמיום ארבע-חמצני (OSO 4) פתרון במנדף, דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 600 μl של 0.1 מ &#39;cacodylate חיץ ולהעביר את המדגם כדי בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ&quot;ל עם מכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את המדגם עבור התייבשות, חדירה והטבעה לתוך שרף (למשל, LX-112) עם שינויים סידוריים של הפתרונים הבאים לפי צלחת גם 6. הזז את פיסת agarose תא גלול באמצעות מלקחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 25% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 50% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם ב 75%<html> אתנול ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 95% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 100% ב RT במשך 15 דקות, פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (3: 1) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 1) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 3) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם שרף טהור ב RT במשך 60 דקות, פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם לתחתית תבנית גומי בצורת קצה הפירמידה באמצעות מלקחיים בזהירות ולהוסיף שרף טהור יותר על גבי המדגם למלא את התבנית. דגירת המדגם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות עבור פילמור שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר הפירמידה שרפה polymerized מהתבניות על ידי סיבוב עובש הגומי. אשכול שחור קטן של תאים צריך להיות גלוי בפירמידת שרף polymerized, כפי שתואר קודם לכן 7. צרף הפירמידה שרף polymerized על גליל הרכבה באמצעות cyanoacrylate. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. חתך במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את בלוק הפירמידה עם סכין גילוח וסכין יהלומים לאחר הרכבת הבלוק על-microtome אולטרה. ליצור צורה טרפזית רחבה קצרה עם החלק העליון והחלק התחתון של מקבילי בלוק זה לזה, ועם צדדים זוויתי באופן שווה. צורה זו של הפירמידה מסייעת עבור חתך סדרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן, לקצץ את הבלוק סביב התא גלול עם סכין היהלום ולהסיר את חלקי הפלסטיק סביב יצירת agarose תא הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 1 מיקרומטר חלקים באמצעות-microtome אולטרה. הזז את 1 מיקרומטר חלקים מהסירה למים לשקופית זכוכית באמצעות כלי עפעף ו כלי לולאת מתכת כפי שדווח בעבר 7. העברת חלקים בשקופיות ומגלשות העברת הצלחת החמה (37 מעלות צלזיוס) במשך ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של תמיסת toluidine הכחולה בסעיפים באמצעות מזרק מצויד 0.22 מיקרומטר מסנן דגירה במשך 3 דקות. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים let בסעיפים לייבוש. בדוק עם מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים סעיפים דקים (70 - 100 ננומטר) באמצעות סכין יהלום. זז 2 - 3 חלקים על רשתות 200-רשת מהסירה למים בכלי זכוכית פטרי באמצעות כלי עפעף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה רשתות עם קטעים על צלחת חמה ב 30 מעלות צלזיוס לייבוש חלקים למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הרשתות עם טיפות של אצטט uranyl 1% ב RT במשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. הכתם עם ריינולדס להוביל ציטראט, ב RT במשך 5 דקות ולשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה את הרשתות על צלחת חמה ב 37 מעלות צלזיוס לייבוש חלקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים, ב 80 kV 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

שיטה זו מאפשרת ניתוח TEM על מספרים סלולריים נמוכים, באמצעות אוונס מכתים כחול agarose ההטבעה למקם תא גלול זעיר במהלך ההתייבשות, הטבעת השרף ו חתך תהליכים. חשוב לציין, היא שומרת צבירי תאים יחד ושומרת על אולטרה-מבנה התא, אשר רצוי לבחון מספר תאי כימות של נתונים. <p class="jove_content" sty...

Ultra-מבניים תת-אברון הפרטים של תאים נחשפו בעיקר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) מחקרים מרקמות או כדורי תא 1,2. חתיכות מוצקות של רקמות יכולות בקלות להיות מנוצלות ללימודים במיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, TEM מנתח 1,3 על תאים בתרחיף להישאר מאתגר להצריך מספרים סלולריים גבוהים, כלומר, מיליוני תאים. בגלל זה, ניתוחים אולטרה-מבניים של אוכלוסיות תאי נדירות השעיה, למשל, בתאי גזע hematopoietic (HSCs), אינם להעריך בקלות. ניסיונות מרובים עבור ניתוח TEM ממדגמים נדירים תוך שימוש בגישות cytospin או בשכבה מצליחים לקבל נתונים כמותיים משמעותי ממספר מצומצם של תאים. לכן, הדרישה של מספר תאים גבוהים מגבילה את השימוש של כלי רב עצמה זה כדי להבין את פרטי ultrastructural subcellular של אוכלוסיות תאים נדירות. מגבלת מפתח ללימודי TEM עם מספר מצומצם של תאs השעיה הוא הלוקליזציה של התאים לעיבוד ולכן, מחקרי TEM מתאי מוגבל עם מידות קטנות במיוחד להישאר מאתגר. מספר גישות חלופיות אומצו כדי להתמודד עם מגבלה זו: ארגון ה- BSA / bisacrylamide (BSA-BA) פילמור בתיווך של השעיה התא, צביעת תאים עם צבע כדי לגרום להם גלוי על תמיכה סרט דק כולל coverslips, ו TEM מנתח מן ההכנות cytospin 4-6. עם זאת, הצלחה מוגבלת מאוד הושגה, כמו מעט מאוד תאים נמצאו בסעיפים לאחר חתך אולטרה. האתגר המרכזי של לזיהוי תאים דלילים נמשך משום monolayer התא אינה נראית בעיקר ג&#39;ל הקרושה עבור חתך. יתר על כן, הכנת cytospin של תאים עשויה לשנות הארגון הסלולר שלהם בשל הפצת תא ואת השבריריות של מבנה התא. לפיכך, חסרונות הגלומים אלה מתחייבים גישה חדשנית לבצע מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות עם יותרעֲקֵבִיוּת. כדי להתגבר על בעיה זו, שתארנו רומן ושיטת הכנת מדגם חלופי מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות 7. כאן אנו מדווחים פרוטוקול הכנת מדגם יעיל לבצע TEM מ דגימות ביולוגיות נדירות עם תוצאות איכותיות וכמותיות עקביות. כתמי כחולי אוונס בוצעו לאחר הקיבוע למקם תא גלול זעיר מתאי מספר נמוך, כלומר, 10,000 מח עצם גזע hematopoietic ו ובתאים שאחרת נותרו בלתי נראה, לבין הגלולה הייתה מוטבעת לתוך agarose לפני תהליכי הטמעת התייבשות שרף. שיטה זו אשכולות התאים יחד ומאפשר ניתוח יעיל של ultrastructure וארגון subcellular של תאי גזע hematopoietic (מזוהה לין - SCA-1 + c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC), 0.2 נדיר - האוכלוסייה 0.5% התא במח העצם. פרו ניסיוני זהtocol יכול להיות שימושי כדי לבצע מחקרים אולטרה-מבניים להשיג תוצאות כמותיות על אוכלוסיות נדירות רבות אבל מאוד חשובות.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16350</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Cacodyladate buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 &amp;deg;C. &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td></tr><tr><td>Evans Blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; stock, &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LX-112 Embedding Kits (LADD&amp;reg;)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Uranyl acetate (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composition: NaCl, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Pyramid tip mold&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>mounting cylinders</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome&amp;nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh grids (nikil)</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>Hitachi model H-7650&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image capture engine software</td><td>AMT-600&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic Petri dishes</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eyelash tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Loop tool&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) ניתן פרטים על ארגון ultrastructure הסלולר. עם זאת, ניתוח TEM של אוכלוסיות תאים נדירות, במיוחד התאים בתרחיף כמו בתאי גזע hematopoietic (HSCs), נשאר מוגבל בשל הדרישה של מספר תאים גבוה במהלך הכנת המדגם. ישנן כמה גישות cytospin או בשכבה לניתוח TEM ממדגמים נדירים, אבל הגישות האלה לא מצליחות לקבל נתונים כמותיים משמעותיים מהמספר המצומצם של תאים. הנה, גישה חלופית ורומן להכנת מדגם במחקרי TEM מתוארת על אוכלוסיות תאים נדירות המאפשרות ניתוח כמוני. מספר תאים נמוך יחסית, כלומר, 10,000 HSCs, שימש בהצלחה לניתוח TEM לעומת מיליוני תאים המשמשים בדרך כלל ללימודי TEM. בפרט, מכתים אוונס הכחול בוצע לאחר paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) קיבעון לדמיין את pel התא הזעירבואו, אשר הקלו מוטבע agarose. אשכולות של תאים רבים נצפו בסעיפים דקים. היו תאי מורפולוגיה השתמרה היטב, ואת הפרטים אולטרה-המבניים של המיטוכונדריה המורכב וכמה Golgi נראו. פרוטוקול יעיל, קל לשחזור זו מאפשר הכנת מדגם ממספר תא נמוך וניתן להשתמש בו לצורך ניתוח TEM איכותי וכמותיים על אוכלוסיות תאים נדירות מ דגימות ביולוגיות מוגבלות.

פרוטוקול יעיל ועקבי להכנת מדגם לבצע ניתוח TEM ממספר נמוך של תאים מתואר. מכתים שלאחר קיבוע עם אוונס כחול העברת התאים צינור 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge עזר להמחיש את התא גלולה זעירה 7. Osmification עם אוסמיום ארבע-חמצני ב agarose הביא לגילוי קל של התא גלולה כהה במהלך ה?...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

Video: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

<meta charset="utf8"></head><body>הכנת דגימה ותכנון ניסיוני לניסויי הקרנת אלקטרונים במיקרוסקופ אלקטרונים מרובה אלומות באתרם

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

הכנת דגימה ותכנון ניסיוני לניסויי הקרנת אלקטרונים במיקרוסקופ אלקטרונים מרובה אלומות באתרם

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

Engineering

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Biochemistry

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

אופטימיזציה של הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

גישה זו לא משוחדת של דגימה TEM מקטעים במדעי המוח

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Neuroscience

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול ממוטב להכנת דגימת אורגנואיד ברשתית עבור TEM

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: ניתוח מבנה העל הסינפטי באורגנואידים רשתית בוגרים באמצעות TEM

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנת דגימה ותכנון ניסיוני לניסויי הקרנת אלקטרונים במיקרוסקופ אלקטרונים מרובה אלומות באתרם

הכנת דגימה ותכנון ניסיוני לניסויי הקרנת אלקטרונים במיקרוסקופ אלקטרונים מרובה אלומות באתרם

טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

אופטימיזציה של הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני

גישה זו לא משוחדת של דגימה TEM מקטעים במדעי המוח

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת