במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול פציעת עור אנושי ex vivo ממוטב שיכול לספק נתוני יעילות חשובים כחלק מצינור תרגום קליני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה מדויקת תפוקה גבוהה של תיקון פצע בעור אנושי חי. מדגים את ההליך יהיו אליזבת רוברטס, חוקרת פוסט דוקטורט, ואלכסנדריה קיד, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו.
כדי להכין דגימת רקמת עור לפצע, מניחים את צד העור למטה בצלחת פטרי 90 מ"מ ולהשתמש במספריים סטריליים כדי להסיר את רקמת השומן. כאשר כל השומן הוסר, מניחים את העור ב 25 מיליליטר של HBSS בתוספת אנטיביוטיקה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם רועד לסירוגין כדי להסיר כל דם שיורית ברקמת השומן. לאחר 10 דקות, לשטוף את העור ב 25 מיליליטר של DPBS.
לאחר 10 דקות, חזור על שטיפת HBSS ללא אנטיביוטיקה, ולאחר מכן בצע שטיפה סופית ב 25 מיליליטר של DPBS. לאחר מכן מניחים קרום מסנן ניילון סטרילי על ערימת כרית סופגת ולייבש את הצד העורי של העור על גזה סטרילית בצלחת פטרי 90 מ"מ כדי להסיר DPBS שיורית. מניחים את צד הדרמיס של העור היבש על מכסה צלחת פטרי 90 מ"מ נקי כדי להסיר כל שאריות DPBS ולטבול את האפידרמיס יבש עם גזה סטרילית טרייה.
כדי ליצור פצע, לחץ על אגרוף ביופסיה של שני מילימטר על העור תוך החזקת העור הדוק ומתפתל בעדינות. בעזרת מלקחיים מעוקלים של רקמה מעוקלת, הרימו כל צד של הפצע בקוטר של כשני מילימטר וחיבור מספריים מעוקלות של איריס מתחת לפצע. השתמש במכה ביופסיה של שישה מילימטר לביופסיה סביב הפצע המרכזי של שני מילימטר כדי ליצור מסלק שישה מילימטר עם פצע חלקי של שני מילימטר במרכז.
לאחר מכן מניחים את צד האפידרמיס המהולל על ערימת ממברנות מסנן הניילון לדגירה של יום עד שבעה ימים ב-32 עד 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. עבור כתמים פלואורסצנטיים, לאסוף את explants הפצע ב 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות המכילים 500 microliters של עור קבוע לכל צינור ודגורת explants לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להחליף את הקיבוץ עם מיליליטר אחד של חוצץ לשטוף כתמים.
לאחר הכביסה, לכסות כל מדגם עם כ 150 microliters של חסימת חוצץ ודגורה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת חיץ החסימה, להוסיף 150 microliters של נוגדן ראשוני מדולל בחסימת חוצץ לכל צינור ודגורת explants הפצע לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם 500 microliters של מכתים לשטוף חוצץ המכיל 0.2% נתרן אזיד ואחריו שלוש שטיפות במאגר כביסה רגיל.
לאחר הכביסה, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של נוגדן משני מתאים מצומד בפלורסנס מדוללים במאגר כביסה מכתים לכל באר לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את explant שלוש פעמים במשך 30 דקות ב 500 microliters של מכתים לשטוף חוצף לכל לשטוף לפני נגד מכתים כל explant עם 150 microliters של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, לשטוף את explant פעמיים במשך 30 דקות עם 500 microliters של חוצץ כביסה לכל לשטוף.
להדמיה מסבירה, הניחו צלחת פטרי 60 מ"מ על פלטפורמת ההדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי והוסיפו שכבה של כמיליליטר של DPBS לצלחת. השתמש במלקחיים כדי להעביר את פצע explants לצלחת. לאחר הגדרת תוכנת ההדמיה בהתאם לניסוי, מקם את הפצע במרכז מישור ההדמיה ורכוש תמונות של ביופסיות הפצע.
כדי לבצע הדמיית מיקרוסקופ דיגיטלי אלחוטי כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה באופן חסכוני, חבר טלפון או מחשב נייד למיקרוסקופ דיגיטלי אלחוטי. מניחים את explants בסופו של דבר על פיסת רקמת מעבדה ולהסיר כל חוצץ לשטוף שיורית מן המדגם. לאחר מכן מקם את המסלק במרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ ורכוש תמונות באמצעות המצלמה המחוברת.
אימונופרוקסידאז ואימונופלואורסצנטיות יכולים לשמש להכתמת רקמת הר שלם. בנוסף, כתמים חיים/מתים יכולים להתבצע על רקמה טרייה ותמונה לפני או לאחר קיבעון. ניתן להשתמש בהכתמת הר שלם של פצעים כדי לקבוע את שיעורי סגירת הפצע באופן לשחזור.
בניתוח מייצג זה, סגירה בריאה של פצעי עור נצפתה לאחר ארבעה עד חמישה ימים, בעוד פצעי עור סוכרתיים לא הצליחו להיסגר באופן מלא בתוך תקופת הניתוח של שבעה ימים. ביטוי K14 הגיע לשיאו ביום השני בפצעי עור בריאים לפני שדעך במהירות עם הבחנה אפידרמית מוגברת. אפיתל מחדש זה ובידול אפידרמיס לאחר מכן התעכבו בפצעי העור הסוכרתיים.
הרפורמציה של מחסום האפידרמיס המוקדם אינה כוללת חדירת נוגדנים K14 בתוך שכבות האפידרמיס המובחנות. בשלב מוקדם של תהליך האפיתל מחדש, K14 קרטינוציטים חיוביים של שכבת בזאלי נודדים פנימה מעל הפצע הפתוח, כך שהאפידרמיס קרוב יותר לקצה הפצע החיצוני נוצר מוקדם יותר מהאפידרמיס הקרוב יותר לקצה הפצע הפנימי. בהמשך שלב התיקון, כתמי K14 הולכים לאיבוד כאשר האפידרמיס מבדיל מבחוץ פנימה.
כתמי הר שלם יכולים לשמש גם כדי ללמוד את הביטוי ואת לוקליזציה של סמנים רלוונטיים פצע אחרים בעור, כמו גם את נוכחותם של תאים חיסוניים של עניין באתר הפצע בשלבים שונים של ריפוי. יצירת פצעים כריתה לשחזור יכול להיות מאתגר בהתחלה. אנו ממליצים לתרגל את הליך הפצע באמצעות עור עודף.
