אימונוהיסטוכימיה שלמה היא טכניקה מהירה ופשוטה יחסית המאפשרת התבוננות מרחבית וזמן של חלבונים ישירות ברקמה או באורגניזם באמצעות נוגדנים מסומנים. התועלת של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הכתמה של רקמה שלמה או אורגניזם מבלי לאורך החלק הראשון שלה מיקרוסקופ קונפוקל יכול לשמש כדי ליצור ייצוג תלת מימדי של דפוס ביטוי החלבון. אימונוהיסטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי להבין את האטיולוגיה ואת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המחלה.
זהו גם כלי אבחון רב ערך לזיהוי גידולים בדגימות פתולוגיות. כדי להתחיל, להכין מיכלי השרצת מלא מי מערכת עם רשת או אניה מחוררת במקום. מניחים זוגות סקס מעורבים של דגי זברה בוגרים בקבוצות בטנקים בן לילה.
השתמש במחזור אור/כהה של 14 שעות/10 שעות עם אורות דולקים בשעה 9 בבוקר.m. למחרת בבוקר, עם האורות דולקים, לשנות את מי מיכל השרץ עם מים במערכת טרייה כדי להסיר צואה. ברגע שהביצים מונחות, החזירו את המבוגרים למיכלים ביתיים.
לאסוף את הביצים על ידי ציור אותם באמצעות פיפטה העברה. מעבירים 50 ביצים לכל צלחת פטרי המלאה באמצע הדרך במדיום העובר. הסר את כל הביצים אטומות ומעונן כי הם מתים או לא הצליחו לחלק.
דגירה צלחת של ביצים ב 28.5 מעלות צלזיוס עד 23 שעות לאחר ההפריה. אם העוברים מבוגרים מ -24 שעות לאחר ההפריה, עם פיפטה להעביר את העוברים ל 200 PTU מיקרומולרי במדיום העובר כדי למנוע מלנוגנזה. תחת מיקרוסקופ סטריאו, dechorionate העוברים unhatched באמצעות מדחפי קצה דקים במיוחד.
שימוש בפיפטות פסטר מלוטשות באש כדי למזער את הנזק, מעבירים אותן לצלחות פטרי מזכוכית או מפלסטיק מצופות 1-2% אגוזה מומסת במדיום העובר. לאחר מכן להעביר את העוברים 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר באמצעות פלסטיק או פיפטה מלוטש אש. הסר מדיום עובר עם מיקרופיגט.
השאירו רק מספיק נוזלים רק כדי לכסות את העוברים. תקן את העוברים ב 4% PFA במשך שעה עד שעתיים עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב 1X PBS ו 1% PBTriton במשך חמש דקות.
יש להשתמש בעוברים באופן מיידי או לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. לאחסון ארוך טווח, התייבשו ואחסנו את העוברים ב-100% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי rehydrate העוברים, לבצע דגירה סדרתית חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר עם כמויות יורדות של מתנול PBS ו PBTriton לשטוף הסופי.
המשך עם הכנת העובר על פי כתב היד. בחר פתרון חסימה התואם את המין המארח של הנוגדנים המשניים, לדוגמה 10% סרום עיזים ב- PBTriton עם או בלי שני מיליגרם למיליליטר של BSA. מוסיפים 0.5 מיליליטר של פתרון החסימה בצינור המכיל את העובר ומ מניחים את הצינור על נדנדה במשך שעה עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר.
ואז להדק את העובר בנוגדן העיקרי מדולל בתתבר חסימה PBTriton לילה בארבע מעלות צלזיוס תוך נדנדה. בבוקר, לשטוף את העובר חמש פעמים PBTriton במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר תוך נדנדה. לאחר מכן בחרו נוגדן משני המבוסס על המין המארח של הנוגדן העיקרי ואורך הגל הרצוי ב-488 ננומטר.
מוסיפים את הנוגדן המשני מדולל בתסימת חסימה לתוך הצינור המכיל את העובר. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום ודגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנדה. לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBTriton במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר בעוד מכוסה רדיד אלומיניום ונדנדה.
עם פיפטה, מעבירים את העוברים לתסכולת 50%גליצרול ב- PBS מעל מיטה של 2% agarose במדיום העובר. כדי להסיר את החלמון, להעביר 200 microliters של 1X PBS לשקופית דיכאון או שקופית זכוכית רגילה. השתמש פיפטה העברת פלסטיק להעביר עובר אחד או יותר טיפת PBS.
השתמש מלקחיים דקים במיוחד כפול אפס סיכות חרקים כדי לשבור את החלמון בעדינות רבה לגרד גרגירי חלמון מפני השטח הגחוני של העובר. הסר את גרגירי החלמון וחדש עם PBS לפי הצורך. לאחר ההרכבה, מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ.
אתר את אזור העניין על-ידי בחירת דוגמה בהירה יחסית. כוונן את החשיפה למצלמה והשיג כך שהאות יהיה בהיר מספיק ללא רוויה. כאשר משווים בין העוברים הניסיוניים המסווים בנוגדנים לבין עוברי נוגדני בקרה, השתמש באותן הגדרות חשיפה.
פרוטוקול זה של אימונוהיסטוכימיה של הר שלם הוא כלי רב ערך לחקר ביטוי חלבון מרחבי וזקתי באמצעות פיתוח זברה-דג. תת-אחת GluN1 של קולטן גלוטמט מסוג NMDA חשפה ביטוי של תת-יוניטים קולטן גלוטמט לאורך פיתוח שרירי הזברה ב 23 שעות לאחר ההפריה. חלקים קפואים של עוברי הפריה 72 שעות לאחר ההפריה הורכבו על מגלשות ו immunostained עבור פוספו-H3, סמן של תאים מתרבים.
מספר תאים הביעו פוספו-H3 והביטוי היה הבולט ביותר באזורי החדר. נוגדן בקרת IgG של עכברים והדרת נוגדנים ראשוניים חשפו רמה נמוכה של ביטוי לא ספציפי. חשוב לבחור פתרונות חסימה מתאימים ונוגדנים משניים המבוססים על הנוגדנים העיקריים המארחים מינים כדי להבטיח זיהוי ולמזער כתמים לא ספציפיים.
יש לאמת את האימונוהיסטוכימיה כדי להבטיח שהאות שנצפה הוא למעשה החלבון המעניין. ניסויי מעקב כרוכים בדרך כלל בשימוש באורגניזמים מהונדסים גנטית או סביבתית. אימונוהיסטוכימיה מעניקה לחוקרים את היכולת להתבונן בחלבונים במקום, ומאיצה מאוד את הבנתנו במערכות רבות בביולוגיה בסיסית ויישמת במיוחד במהלך התפתחות העוברים.
מתנול ופורמלדהיד רעילים ויש לטפל בהם בזהירות. יש לאסוף פסולת ולהיפטר מהן בהתאם לנהלים המוסדיים.
