Name: organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

ברצוננו להודות לחברי הקבוצה לאונקולוגיה גינקולוגיה לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו בוצעה שנשען בחלקו על ידי מימון בריאות ממלכתי המועצה למחקר רפואי, המועצה למחקר האוסטרלי, ואת NSW מכון הסרטן (PST). ח&quot;כ הוא הנמען של אוניברסיטת מחקר אחוות שלאחר התואר הראשון ניוקאסל.

טיפול בבעלי חיים הפרוצדורות בוצעו בהתאם להנחיות של טיפול בבעלי חיים ועדת האתיקה של אוניברסיטת ניוקאסל אישר חוק בעלי חיים למחקר ניו סאות &#39;ויילס, ניו סאות&#39; ויילס החיה מחקר תקנה, ואת קוד האוסטרלי של טיפול השימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. כל נוהל שיושם על עכברים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ואתיקה של אוניברסיטת ניוקאסל. 1. זמן הזדווגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג 6 - 8 שבועות זכר ישן עכברות רק לפני סוף מחזור אור יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הנקבות עבור הנוכחות של תקעי נרתיק הבוקר מוקדם (או לפני 8.00 בבוקר), כל יום. יום של תקע נחשב 0.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הנקבה עם תקע הנרתיק לתוך כלוב חדש (בלי זכר) ואת התווית מועד תקע. </li></ol> 2. בידוד של רכסי אשכי עכבר עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד עכבר embryonic רכסים האשכים מ -15.5 לנשים בהריון DPC כמתואר 9, עם כמה שינויים כמפורט להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דיסקציה לפני הצהריים כזמן נשים בהריון נחשבות להיכנס למחרת של ההריון על ידי אחר הצהריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב 15.5 לנשים בהריון DPC באמצעות נקע בצוואר רחם (או על פי הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית בעלי החיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העכבר על גבו על נייר סופג ולרסס את הצד הגחוני של הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור בבטן התחתונה (צד הגחון) עם מלקחיים ולעשות חתך לרוחב באמצעות מספריים כירורגיות, המשתרעת הפתיחה ואברי המין עד הסוף כדי כלוב הצלעות. משוך את העור לכיוון הראש של החיה על מנת לחשוף את הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את שרירי הבטן עם מספריים כירורגיות לחשוף חלל הצפק. תפוס את הרחם הרה להולדת עם מלקחיים מעל צוואר הרחם ולעשות חתך. עכשיו להרים את הרחם על ידי לחיצה על to בשלפוחית ​​השתן לחתוך את רצועת הרחם רחב ואחריו חתכים בצמתים uterotubal לנתק הרחם מן מצורף הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרחם לתוך צינור 50 מ&quot;ל המכיל קר כקרח HBSS (תמיסת מלח מאוזן של האנק). שטוף את הרחם הרה להולדת בעדינות עם HBSS קר כקרח כדי להסיר את הדם העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור הרחם בצלחת פטרי המכילות HBSS קר כקרח ולשמור על הקרח. חותכים את דופן הרחם ולהוציא את העוברים. שמור את העוברים בצלחת פטרי טריה עם HBSS על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח נייר טישו סטרילי נקי והנחת אותו על צלחת פטרי חדשה. תרסיס אתנול 70% על נייר טישו. שמור העובר על נייר זה בצד לרוחב ופצע אותו מן הבטן התחתונה באמצעות סכין סטרילית בכיוון כפי שמוצג על ידי הקו המקווקו באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העובר על בסיס ספוג סטרילי ידי מצמיד את עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אותו תחת סטראו לנתח לחתוך בזהירות לאורך קו האמצע הגחון. הסר את הכבד והמעיים. מערכת המין ודרכי שתן עכבר (כליות, שופכן, testis, WD, ואת זרע הזרע) כעת אמורה להיות גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את testis ואת WD, ולשמור בצלחת פטרי טריה עם HBSS, על קרח. כדי להוציא את WD ו testis, לחתוך את זרע הזרע הקרוב זיקתו השופכה לחתוך את הקובץ המצורף של חלק תחתון של WD מן gubernaculum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינת האשכים ו- WDS מן העוברים מאותה הקבוצה (עשוי להשתנות לפי התכנית הניסיונית). </li></ol> 3. תרבות של רכסי האשכים עובריים (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני עבור culturing רכסי האשכים העובריים ידי השלמת DMEM / F12 עם 10% FBS (בסרום שור עוברי), 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו 1% L- גלוטמין. מומלץ לחמם את התקשורת כדי 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL של התקשורת לכל גם צלחת תרבית תאים 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח צלחת פטרי טריה לשים טיפה קטנה של HBSS סטרילי עליו. שים קרום לחרוט פוליקרבונט המסלול (0.881; מ &#39;) על ירידה זו של HBSS עם המשטח הנוצץ שלה מול HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים נקיים באמצעות לשים שני WDS ואשכים על הממברנה (על המשטח המחוספס שלה, פונה כלפי מעלה) ולהסיר את הסכום המקסימאלי של HBSS שימוש במגבונים סטריליים / נייר סופג. אל תיגע רקמות עם נייר סופג; אחרת, זה יהיה נזק לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי לא WDS ולא בלוטות המין הם נוגעים זה בזה. אחרת, הם יוכלו להישאר ביחד במהלך הדגירה לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הממברנה עם הרקמות גם צלחת 24-היטב המכילה בינוני תרבות 300 μL ותרבות אותם ממשק אוויר-בינוני. מדיום תרבות מדי על תוצאות ממברנות ב גידול פיברוזיס של WDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 ° C חממה, בנוכחות של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את מדיום התרבות מדי יום. כדי לשנות את המדיום עם פיפטה, להסיר את המדיום מן הבאר הראשונה ולאחר מכן להוסיף 300 μL של המדיום החדש prewarmed. הערה:לקבלה אשר בדק את השפעתו של מסלולי איתות שונים על morphogenesis WD, activators הכימי ו / או מעכבים בריכוזים נדרשו ניתן להוסיף עד בינוני התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות הרקמות עבור 3 ד. בתוך 3 ד, uncoiled WDS שנאסף מעובר 15.5 DPC להפוך צינורות מפותלים מאוד (איור 3 ב). תוספת של מעכב Wnt, IWR1, התוצאה היא עיכוב של WD התפתלות (איור 3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקציר רקמות אלה לקחת צלחת פטרי עם קרים כקרח PBS. מעביר את הממברנה עם בלוטת מין תרבותי WD לתוך צלחת פטרי. הקרום יצוף על PBS. לחצו על הממברנה ולהשקיע אותו PBS ולהוציא את בלוטת המין ו WD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הרקמות עם paraformaldehyde 4% (PFA) O / N ב 4 ° C או עבור 1 ש &#39;ב RT. במידת הצורך, לקחת תמונות שדה בהירות של WDS לפני הקיבעון. </li></ol> 4. Immunofluorescence הר שלם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הרקמות הקבועות 3x עם PBS-T (PBS + 1%טריטון X-100) עם נדנדה איטית, 10 דקות כל אחד, ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הרקמות בסדרת אתנול מדורגת (25%, 50%, 75% ו -100%), 10 דקות כל אחד, ב 4 ° C, עם נדנדה איטי (~ 30 סל&quot;ד). בשלב זה, הרקמות ניתן לאחסן 4 ° C באתנול 75%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשנות את אתנול, לשמור על הרקמות ללא הפרעה במשך 2 דקות ולתת הרקמות להתיישב. להוציא supernatant ככל האפשר ולאחר מכן להוסיף את הריכוז הגבוה הבא של אתנול. כדי למנוע נזק לרקמות, קצה פיפטה צריך תיגע רקמות בכל שלב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התייבשות, רעננותם הרקמות בסדרת אתנול מדורגת (100%, 75%, 50% ו -25%), 10 דקות כל אחד, ב 4 ° C, עם נדנדה איטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הרקמות עם PBS-T (PBS + 0.1% Triton X-100), 4x, 20 דקות כל אחד, ב RT, עם נדנדה עדין (~ 30 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הרקמות של 1 ש &#39;ב RT עם חסימת חיץ (PBS + 1% BSA + 0.2% דל שומן יבש אבקת חלב + 0.3% Triton X-100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> After חסימה, להעביר את הרקמות פתרון נוגדן ראשוני (מדולל חסימת חיץ) דגירה O / N ב 4 ° C עם נדנדה עדין (~ 30 סל&quot;ד). דילולים של הנוגדנים העיקריים בשימוש מתוארים לוח החומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף רקמות עם PBS-MT (PBS + 2% דל שומן יבש אבקת חלב + 0.5% Tween-20), 4x, 30 דקות כל אחד, ב RT, עם נדנדה עדין (~ 30 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צעד זה כביסה, להוסיף נוגדנים משני בדילול של 1: 250 (צעד זה צריך אופטימיזציה עבור נוגדנים אישיים) במאגר חסימת דגירה של 1 ש &#39;ב RT, עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעתה ואילך לשמור על הרקמות מכוסות בנייר אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור כמו נוגדנים משני מסומנים עם fluorophores הרגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמות 3x עם PBS-T (-20 Tween% PBS + 0.1), 30 דקות כל אחד, עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שקופיות להרכבת הרקמות המוכתמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל זה, לחתוך את תלושי זכוכית המכסהלרצועות דקות באמצעות עט יהלומים ואת מקל שתי רצועות אחד על הפנים השניים בשקופית הזכוכית באמצעות אמייל מסמר. הפוך שני גבולות ורקמות מקום בין שני הגבולות האלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני הרכבה המכיל DAPI ולבש להחליק את המכסה. החל אמייל מסמר בזוויות להחליק את המכסה כדי לתקן את זה לשקופית. הערה: רקמות מוכנות כעת הדמיה. אחסן את השקפים האלה ב -20 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

מערכת התרבות האיבר יש יתרונות רבים על פני מערכת תרבית תאים המסורתית. מערכת זו שומרת על יחסים ואינטראקציות מבניים המקוריים בין סוגי תאים שונים. הוא מחק במערכות vivo ומעניק מידע מדויק יותר לימודי תרבות תא שבו הגורם הנישה נעדרת. השימוש במערכות תרבות איברים קיימים גם ...

מערכת הרבייה של הגבר בעיקר מורכבת testis, האתר לפיתוח ניבט תא והבחנה, ומערכת ductal מורכבת דרושה ההתבגרות, תחבורה, והאחסון של זרע. יותרת האשך הוא איבר צינורי שמחבר testis עם vas הזרע ומעורב בעיקר בפיתוח שלאחר האשכים והתבגרות של תאי נבט 1. העכבר מבוגר מפותל מאוד יותרת האשך מפתחת משפופרת מבשר פשוט ישר, צינור Wolffian (WD) 1. המבנה מורכב מפותל של יותרת האשך חיונית זרע לרכוש את היכולת להפרות בתאי הנבט נקבה 2. איך איבר כזה חיוני פוריות הגבר מתפתח ומקבל לכושר אינה מובנת היטב. מסלולי איתות שונים הוכחו להיות מעורב בפיתוח של WD כגון מסלול איתות Wnt 3,4 ואת אנדרוגן במסלול איתות 5. העבודה האחרונה שלנו הקימה את הדרישה של Balanced Wnt איתות עבור התפתלות WD במהלך ההתפתחות טרום לידתי 4. עם זאת, מחקרים נוספים נדרשים כדי להבין את המנגנונים המעורבים התפתלות epididymal לאחר הלידה, התמיינות תאים, ואת התא אל התא תקשורת בתוך האפיתל epididymal ועם תאים ביניים. גנטי במודלים של עכברים מהונדסים הוכחו להיות כלי רב עצמה לזיהוי / אימות של מנגנונים מולקולריים שבבסיס התפתחות ומחלות של מערכות איברים שונות 6. למרות השימוש הנרחב שלה, קיימות מגבלות משמעותיות של מודלי עכבר מהונדסים גנטי, כוללים את הפנוטיפ הצפויה של מוטנטים עכבר ממוקדים לגבי תפקוד גן משוער, ולא פנוטיפ מוטנטים null בדגמים מסוימים, השפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים, עבודה אינטנסיבית זמן רב בתהליך של פיתוח מודלי עכבר. לכן, הפרשנות של המשמעות של הממצאים רק גנטי מודיםמודלי עכבר fied אינם תמיד ברור 6. ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות מערכת תרבות איבר במבחנה אשר נותנת לנו את הגמישות כדי לתפעל מסלולי איתות מרובים בזמן אמת בתנאי תרבות מבוקרת. מערכת תרבות איברים היא סייעה בהבנת הפיזיולוגיה והפתולוגיה של איברים שלמים 7. יתר על כן, הדמיה של כל איברים מוכתמים נוגדנים שכותרתו fluorophore מאפשרת לנו לדמיין את הסמנים של עניין בהקשר תלת ממדי, כפי שהיא קיימת in vivo, ובכך לספק הבנה טובה יותר של הצורה של האיבר, מבנה ותפקוד 8. הנה, יש לנו תארנו את השיטות לבידוד תרמי של רכסי אשכים עובריים בעכבר, במבחנת תרבות הדמית immunofluorescence הר שלמה של WDS, שניתן ליישם כדי לענות על מגוון של שאלות הנוגעות morphogenesis איברים צינורי כגון WDS. בפרוטוקול זה, אנועכבר מבודד עובריים רכסים ואברי המין מ -15.5 ימים שלאחר coitum (DPC) סכרים בהריון מתורבת אותם במשך 3 ד ואחריו immunostaining עבור סמן תא אפיתל (cytokeratin 8, CK8), סמן התפשטות תאים (phospho-היסטון 3, PH3) ופעיל βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&amp;nbsp; Australia</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS used in culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>Membrane (0.8 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &amp;micro;M concentration used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot&lt;br/&gt; be disposed of in the sink</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>active &amp;beta;catenin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>n-Propyl galate</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Cover Slips (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

morphogenesis תובל היא דרישה בסיסית לפיתוח רוב האיברים יונקים, כולל מערכת הרבייה הגברית. יותרת האשך, חלק בלתי נפרד של מערכת הרבייה של הגבר, הוא אחראי על אחסון הזרע, התבגרות, ותחבורה. יותרת האשך המבוגרת הוא צינור מפותל מאוד שמתפתח מבשר עוברי פשוט ישר המכונה צינור Wolffian (WD). התפתלות תקין של יותרת האשך חיונית פוריות הגבר, כמו זרע ב testis אינם מסוגלים להפרות ביצית. עם זאת, המנגנון האחראי לפיתוח epididymal ואת התפתלות עדיין לא ברור, בין השאר בגלל חוסר שיטות תרבות הדמיה כולו איברים. במחקר זה, אנו מתארים מערכת תרבות במבחנה פרוטוקול immunofluorescence הר שלם כדי להמחיש את התהליך טוב יותר של התפתלות WD ופיתוח, אשר עשוי להיות מיושם גם ללמוד איברים צינורי אחרים.

במהלך הפיתוח, WD עובר שינויים משמעותיים שבו צינור פשוט ישר הופך דביק מורכב מפותל מאוד. באמצעות שיטות שתוארו לעיל, WDS עוברת טרנספורמציה דומה בתנאי תרבות. כאן אנו הראינו את התוצאות של WDS בתרבית למשך 3 ד (איור 3). כדי לנתח מנגנונים מולקולריים המעורבים המורפוגנזה WD, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

אנו מציגים שיטה בידוד והתרבות של צינור העכבר Wolffian (WD). אנחנו גם מדגימים נוהל מפורט immunostaining הר שלם של WDS תרבותי / טרי מבודד עם נוגדנים מתויג fluorescently. יחד, טכניקות אלו מאפשרים את חקר התפתחות WD, התפתלות, והבחנה.

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  University of Newcastle.  אנו מציגים שיטה בידוד והתרבות של צינור העכבר Wolffian (WD). אנחנו גם מדגימים נוהל מפורט immunostaining הר שלם של WDS תרבותי / טרי מבודד עם נוגדנים מתויג fluorescently. יחד, טכניקות אלו מאפשרים את חקר התפתחות WD, התפתלות, והבחנה. 

Video: Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Cancer Research

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה תלת מימדית של אורגנואידים לחקר ריסים ראשוניים במהלך אורגנוגנזה ex vivo

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

הדמיה תלת מימדית של אורגנואידים לחקר ריסים ראשוניים במהלך אורגנוגנזה ex vivo

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetics

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

אקסטרה סלולר מבוסס מטריצה ודור נוסף ללא מטריקס סלולרי של אורגנואידים אשכים Murine

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neuroscience

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biology

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שימוש

זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

הדמיה תלת מימדית של אורגנואידים לחקר ריסים ראשוניים במהלך אורגנוגנזה ex vivo

הדמיה תלת מימדית של אורגנואידים לחקר ריסים ראשוניים במהלך אורגנוגנזה ex vivo

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

אקסטרה סלולר מבוסס מטריצה ודור נוסף ללא מטריקס סלולרי של אורגנואידים אשכים Murine

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב