Le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est compliqué et prend beaucoup de temps. Ce protocole optimisé peut générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité élevée et sans frais. L’avantage de ce protocole est la quantification de la taille EB et de la densité de placage pour améliorer considérablement l’efficacité et la répétabilité de l’induction rétinienne à partir de CSEh.
Avec cette méthode, toutes les principales cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement et récapitulent les principales étapes du développement rétinien. Il facilitera la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire pour les maladies dégénératives rétiniennes. Pour démontrer la procédure, nous sommes avec Yuanyuan Guan, un doctorant, et Bingbing Xie, un technicien du laboratoire.
Commencez par préparer 50 mL de solution ECM en ajoutant 1 mL de la troisième solution mère 50 fois à 50 mL de DMEM. Ensuite, ajoutez 1 mL de cette solution ECM préparée à chaque puits d’une plaque de six puits et incubez-la pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Préparez le support d’entretien hPSC conformément aux instructions du fabricant et préchassez-le à la température ambiante pendant 30 minutes.
Versez un flacon cryogénique de CSEh à partir d’un réservoir d’azote liquide en l’incubant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes. Désinfectez-le soigneusement à l’aide d’un spray à 75% d’alcool et mettez-le dans une armoire de biosécurité. Transférer la suspension cellulaire du flacon dans un tube de 15 millimètres.
Ensuite, ajoutez 5 mL de milieu d’entretien préchauffé goutte à goutte au tube à l’aide d’une pipette de 5 mL, tout en secouant doucement le tube pour mélanger les hPSC. Centrifugez le tube à 170 fois G pendant cinq minutes. Retirez soigneusement la majeure partie du surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL, en laissant derrière vous environ 50 microlitres de surnageant pour éviter de perdre les cellules.
Re-suspendez la pastille avec 1 mL de support d’entretien en pipetant de haut en bas. Retirez l’ECM des puits pré-enduits et ajoutez 1,5 millilitre de milieu d’entretien à chaque puits. Répartissez ensuite 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits.
Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les hPSC. Mettez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 24 heures pour favoriser l’adhérence cellulaire. Changer de milieu tous les jours et passer les hPSC à 80% de confluence.
Le jour 0, initiez la différenciation en retirant les cellules de confluence à 80% d’un puits de la plaque à six puits. Recueillir les cellules avec une solution de dissociation EDTA comme décrit dans le manuscrit textuel. Retirer la solution d’EDTA et ajouter 1 mL de milieu d’entretien contenant 10 fluvastatines micromolaires pour arrêter la dissociation cellulaire.
Prélever les cellules avec une pipette de 1 mL. Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de Petri ultra-basse de 100 millimètres et ajouter 9 mL de milieu d’entretien contenant 10 fluvastatines micromolaires à la boîte. Secouez doucement le plat deux fois pour répartir uniformément les cellules.
Ensuite, mettez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Une fois les cellules cultivées pendant au moins 24 heures, observez-les au microscope. Ajouter 9 mL de support d’entretien et 3 mL de NIM à un tube de 15 mL.
Transférer les cultures cellulaires dans un tube centrifuge de 15 mL et ajouter 10 mL du mélange NIM préchauffé à la boîte. Centrifuger le tube à 60 fois G pendant 3 minutes pour recueillir les agrégats. Retirez ensuite le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL, en laissant derrière lui environ 500 microlitres pour éviter de perdre des cellules.
Ajouter 2 mL du mélange dans le tube et transférer la suspension dans la même boîte de Pétri. Secouez doucement le plat pour répartir uniformément les agrégats cellulaires. Ensuite, remettez le plat dans l’incubateur.
Le jour 5, retirez l’ECM des plats pré-enrobés et ajoutez 10 mL de NIM préchauffé à chaque plat. Sortez le plat contenant des Ebs et vérifiez la qualité des EB au microscope, en vous assurant qu’ils sont brillants et ronds. Recueillir tous les EBs dans un tube de 15 mL et les laisser se déposer pendant 5 minutes.
Ensuite, retirez la majeure partie du surnageant, en laissant derrière vous environ 2 mL de milieu. Après avoir compté les BOULE, ensemencez-les goutte à goutte à une densité d’environ 2-3 BOULEs par centimètre carré dans des plats enrobés contenant 10 mL de NIM. Secouez doucement les plats pour répartir uniformément les BOULE et mettez-les dans l’incubateur pendant au moins 24 heures.
Utilisez une aiguille en tungstène ou une aiguille avec une seringue de 1 mL pour détacher mécaniquement les vésicules optiques morphologiquement identifiables, ainsi que l’épithélium pigmentaire rétinien adjacent aux jours 28 à 35. Culturez-les en suspension. Mettez 50 à 60 vésicules optiques dans chaque boîte de culture à faible fixation de 100 millimètres, contenant 15 mL de RDM pour la formation d’organoïdes rétiniens.
Changez le support tous les 2 à 3 jours jusqu’au jour 42. Pour initier la différenciation rétinienne, les CSEh ont été dissociés en petites touffes et cultivés en suspension, qui ont formé des CE depuis le jour 1. Le jour 5, les ABE ont été plaquées sur les boîtes de culture revêtues d’ECM et les cellules ont progressivement migré hors des EBs.
Le jour 16, le milieu d’induction a été remplacé par rdM, provoquant la formation des domaines neuronaux de la rétine et la saillie progressive de la boîte, ainsi que la formation de cellules de structures ressemblant à des vésicules optiques entourées de cellules RPE. Pendant les jours 28 à 35, organoïdes rétiniens constitués de la rétine neurale, attachés à une sphère RPE. D’un côté, des cellules se sont formées.
Au fur et à mesure que la différenciation et la spécification de la rétine progressaient, les CSH produisaient des sous-types de rétine neurale qui s’alignaient progressivement en couches, imitant les caractéristiques architecturales d’une rétine humaine native. Les cellules ganglionnaires de la rétine ont d’abord été générées à partir de progéniteurs rétiniens et accumulées dans la face basale de la neuro-rétine. Avec ce protocole, les organoïdes rétiniens se sont développés en photorécepteurs très matures avec à la fois des bâtonnets et des cônes riches.
Les cellules photoréceptrices étaient situées du côté apical, tandis que les cellules amacrines, les cellules horizontales, les cellules bipolaires et les cellules gliales muller étaient toutes situées dans la couche intermédiaire de la rétine neurale. Les points clés de ce protocole sont la création d’Ebs de haute qualité et leur ensemencement à la bonne densité.
