פרוטוקול זה מספק גישה פרה-קלינית לגילוי ותיקוף טיפולים תרופתיים למחלות רשתית מטבוליות ישירות בתוך רקמת הרשתית האנושית. טכניקה זו משלבת את מורכבות חילוף החומרים ברקמות אנושיות עם הרבגוניות והתפוקה של תרבית תאים. השתמשנו בבדיקה זו כדי להשיג נתונים פרה-קליניים לטיפול במחלה הניוונית של הרשתית, MacTel, באמצעות תרופה נפוצה ובטוחה לשינוי שומנים, פנופיברט, שנמצאת כעת בניסויי בטיחות קליניים.
גישה זו יכולה להיות מיושמת על מספר רב של גורמי לחץ נפוצים ברשתית שמובילים למחלות, כולל מחסור בחומרים מזינים, היפוקסיה, רעילות אור ושומנים רעילים אחרים. בשבוע 24 של התרבית, לבדוק את האורגנואידים להיווצרות של מקטעים בסיסיים בצד החיצוני של האורגנואיד. בשבוע 26 עד 28, המקטעים החיצוניים היו אמורים ליצור שכבה עבה.
כאשר ניתן להבחין במקטע ספק מעובה, יש לדלל תמיסת מלאי deoxySA של מילימולרית אחת ל-0.51. ריכוז מיקרומולרי אחד ושניים בשלושה מיליליטר של מדיום התמיינות רשתית פלוס. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה וגשושית סטרילית, בחרו ארבע קבוצות אורגנואידים בערך באותו גודל וצורה עם מינימום של חמישה אורגנואידים לכל קבוצה, וחלקו את הקבוצות לבארות נפרדות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד בעלת 6 בארות.
לאחר איסוף כל האורגנואידים, הסירו כמה שיותר מדיום מכל באר והוסיפו ריכוז אחד של תמיסת deoxySA לכל באר. הוסף את בקרת הרכב לקבוצה הרביעית של אורגנואידים. לאחר יומיים של תרבית, החליפו את הסופרנאטנטים של התרבית ב-deoxySA טרי מתאים או בדילול בקרה.
לאחר ארבעה ימים של תרבית, הטמיעו את החלק הקפוא והכתימו את האורגנואידים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי לאפשר הערכה של מוות התא בכל תרבית. לאחר הצביעה, השתמשו בהגדלה של פי חמישה עד פי 10 כדי לאתר אזור של חתך האורגנואיד החתוך שהוא שלם, מעוצב היטב, ובמישור הדוגם חתך מייצג של האורגנואיד. החלק צריך להיות בעל שכבה גרעינית חיצונית נפרדת של פוטורצפטורים בעובי של לפחות כמה תאים, ושכבה נפרדת ומובחנת של גרעינים שאין להם התאוששות וצביעה.
מסגר את התמונה והגדל את ההגדלה ל- 20x. לאחר מכן, מסגר שוב את השקופית כדי למלא את התמונה בכמה שיותר משכבת קולטני האור. קבעו את מישור Z וקבעו את הגבולות התחתונים בקצה העליון של טווח Z כדי לצלם את כל עומק הפרוסה.
לאחר מכן צבעו את כל שלושת ערוצי הפלואורופור ברכישת מחסנית Z, ושמרו את התמונה בתבנית קובץ השומרת על יחס השטח לפיקסל. כדי לכמת את מספר התאים המתים בכל דגימה, פתחו את ערימות התמונות בפיג'י. בחלון אפשרויות הייבוא של הפורמט הביולוגי, ודא שלא מסומנות תיבות תחת המקטע פיצול לחלונות נפרדים ובחר תמונה, ערימות ופרויקט Z כדי ליצור תמונה חדשה לכימות.
בחרו בערוץ התמונה שמציג את השחזור והצביעה, והשתמשו בכלי בחירת מצולע כדי לשרטט אזור רציף של פוטורצפטורים בתמונה. לחצו על 'נתח וקבע מדידות' ובחרו בתיבה 'אזור'. לחץ על נתח ומדוד, כדי למדוד את שטח הפוטורצפטורים כדי לספור את התאים הגוססים.
המדידה תופיע בחלון מוקפץ. כדי לספור את גרעיני האפופטוזיס החיוביים באזור הפוטורצפטור שנבחר, לחצו לחיצה ימנית על הכלי נקודה לבחירת הכלי הרב-נקודתי ובחרו את הצביעה החיובית של אפופטוזיס החופפת לגרעינים חיוביים של DAPI ולשחזור וצביעה. עבור בין הערוצים כדי לאמת את התאים החיוביים.
לאחר מכן מחלקים את מספר התאים החיוביים לאפופטוזיס לפי האזור כדי לקבל ערך מנורמל למוות התא בתוך הפוטורצפטורים לכל אורגנואיד. לאחר קביעת ריכוז deoxySA שגורם למוות של תאי המטרה, השתמש בבדיקה סטרילית כדי לבחור שלוש קבוצות של אורגנואידים בערך באותו גודל וצורה עם מינימום של חמישה אורגנואידים לכל קבוצה. ולהוסיף את הקבוצות לבארות בודדות של צלחת 6 בארות חיבור נמוכה במיוחד.
הוסף את ריכוז מוות תאי המטרה של deoxySA, ריכוז מוות תאי המטרה של deoxySA בתוספת התרופה המעניינת או מדיום הבקרה לבאר או אורגנואידים המתאימים. לאחר יומיים, יש להחליף את הסופרנאטנט בכל באר בריכוז המתאים של מדיום טיפול טרי או אמצעי בקרה. לאחר ארבעה ימים של תרבית, להעריך את התרביות עבור מוות תאים כפי שהודגם.
בניתוח מייצג זה, אורגנואידים ברשתית שנוצרו מקו תאי גזע פלוריפוטנטיים מסוג 2 שאינם מקולריים טופלו בארבעה ריכוזים של deoxySA. מוות תאי בתגובה ל-deoxySA היה תלוי ריכוז וניתן היה להבחין בו ב-50 ננו-מולאריים בלבד. הריכוז הגבוה ביותר שנבדק גרם למוות תאי חזק תוך שמירה על שלמות האורגנואיד ברשתית.
טיפול בפנופיברט 20 מיקרומולרי מנע רעילות הנגרמת על ידי deoxySA בקולטני הצילום של אורגנואידים ברשתית, והפחית משמעותית את מוות התאים בכ-80% לאחר ארבעה ימי טיפול. זכור לבחור אורגנואידים מעוצבים ובריאים כדי להבטיח שהבדיקה מבוצעת בתאי רשתית. ניתן לעבד את האורגנואידים לאיסוף RNA כדי לכמת ביטוי גנים, מה שמאפשר הערכה של אותות לחץ ותיקוף של השפעות רעילות והצלות.
באמצעות טכניקה זו, הצלחנו להעריך את חילוף החומרים במורד הזרם של מספר שומנים שונים באורגנואידים, ולפתוח את המחקר של מטבוליזם שומנים ברשתית האנושית.
