פרוטוקול זה חושף תאים סרטניים בהשעיה לפולסים קצרים של לחץ גיסת נוזלים כדי לחקות היבטים מסוימים של האופן שבו תאים סרטניים גרורתיים נחשפים לכוחות המודינמיים בזמן שהם במערכת הדם. זוהי טכניקה פשוטה יחסית ליישם פולסים קצרים של מתח גיסת נוזלים ברמה גבוהה. בעת ניסיון פרוטוקול זה, להיות זהיר על מחטים לא מכופתרות ולא לכופף אותם כמו זה ישנה מתח גיסת כוח מיושם.
הליך זה עשוי לייצר תרסיסים, לכן להשתמש באמצעי בטיחות מתאימים. כדי להתחיל, לשחרר 70 עד 90% תאי PC3 confluent מצלחת תרבית הרקמות על ידי שאיפה מדיום הצמיחה לשטוף את צלחת 10 ס"מ עם חמישה מיליליטר של סידן ומגנזיום ללא PBS. לאחר מכן, לשאוף PBS ולהוסיף מיליליטר אחד של 0.25%טריפסין.
לאחר טריפסיניזציה, התבונן בניתוק התאים תחת מיקרוסקופ הפוך. כדי לעכב את טריפסין, להוסיף חמישה מיליליטר של DMEM / F12 בינוני המכיל 10%FBS. לאחר מכן, למקם את השעיית התא לתוך צינור חרוטי ולקבוע את ריכוז התא ואת מספר התא הכולל.
צנטריפוגה השעיית התא ב 300 x g במשך שלוש דקות, ולאחר מכן לשאוף supernatant ול resuspend הכדור במדיום תרבית רקמות ללא סרום. חותכים סביב תחתית צינור פוליסטירן 14 מיליליטר בקו שבעמיליליטר ומניחים את השעיית התא המעורב לתוך הצינור לחתוך. בנפרד לאסוף דגימות שליטה סטטית של תאים לפני חשיפה ללחץ גיסת נוזל לשימוש לביצוע בדיקות.
כדי לחשוף את דגימת השעיית התא הנותרת ללחץ גיסת נוזלים, למשוך את השעיית התא לתוך מזרק חמישה מיליליטר ולחבר מחט 30 מד חצי אינץ '. מניחים ומאבטחים את המזרק עם מחט לא מרופפת על משאבת מזרק ומגדירים את קצב הזרימה כדי להשיג את הרמה הרצויה של מתח גזירה נוזלי. הפעל את משאבת המזרק ולאסוף את המדגם הגיה בצינור לחתוך בזווית של כ 45 מעלות כדי להפחית קצף.
בזהירות להסיר את המזרק ממשאבת המזרק ולהשתמש צבת כדי להסיר את המחט, דואג לא לגעת בו. חזור על ההליך עד השעיית התא נחשף למספר הרצוי של פולסים של מתח גזירה נוזל. בצע בדיקות קיימא עם דגימות סטטיות לפני חשיפת התאים ללחץ גיסת נוזלים.
לבדיקות אנזימטיות, העבר 100 עליקוטים מיקרוליטרים מהדגימות הסטטיות בשכפול לצלחת של 96 בארות. לאחר מכן, לאסוף 100 microliters של דגימות לאחר חשיפה ללחץ גיסת נוזלים ומניחים אותם בצלחת 96-well. הוסף 20 מיקרוליטרים של פתרון 0.15 מיליגרם למיליליטר resazurin לכל דגימה באר ובארות המכילות 100 microliters של בינוני בלבד.
לדגור על לוחות הבאר באינקובטור תרבית הרקמה של 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ואז למדוד את הפלואורסצנטיות והספיגה באמצעות קורא לוחות ולקבל את אחוז התאים קיימא על ידי השוואת האות הממוצע מכל אחד מהדגימות שנחשפו ללחץ הגניסוח הנוזלי לדגימת הבקרה הסטטית הממוצעת. באופן דומה, לאסוף aliquots מדגימות סטטיות כדי לבצע ציטומטריה זרימה וביקורות clonogenic כמתואר בכתב היד הטקסט. בניתוח הייצוגי, הכדאיות של תאי סרטן מאציים של מיתל סמיטרי סינגני הוערכה באמצעות המרה resazurin לאחר חשיפת תאים למספר פולסים מתח גזוז נוזל.
למרות שכל קו תא הציג פרופילי התנגדות שונים, לא היה הבדל משמעותי ביסיות לאחר 10 פולסים של חשיפה ללחץ גזירה נוזלית. קווי תאים סרטניים נוספים ממגוון מקורות רקמות הדגימו את הכדאיות של יותר מ -20% לאחר 10 פולסים של מתח גיסת נוזלים, למעט תאי MIA PaCa-2, שהראו כדאיות של פחות מ -10% עקב רגישות להרס מכני מלחץ גיסת נוזלים. בעת איסוף המדגם הסטטי לפני החלת נוזלים לגנות מתח, להבטיח כי השעיית התא הוא הומוגני מעורב.
בזהירות להסיר את המחט עם צבת ולא לכופף או לגעת במחט. בנוסף למדידת הכדאיות של התא, ניתן להעריך שינויים בביטוי הגנים, איתות התאים, ההתפשטות והנדידה. באמצעות זה כמודל של חשיפה ללחץ גיזום נוזלים, אפשר ללמוד הן כיצד תאים סרטניים להתנגד הרס על ידי מתח גיזום נוזל ולהעריך את ההשפעות של לחץ גיזום נוזלים על הביולוגיה של תאים סרטניים.
טכניקה זו שימשה את המעבדה שלנו ואחרים כדי לחקור את ההשפעות של לחץ גזל נוזלים על תאים סרטניים במחזור. מחקרים אלה הראו כי לחץ גיסת נוזלים משנה במהירות את התכונות המכניות של תאים סרטניים וכי זה תורם ליכולת של תאים סרטניים להתנגד להרס על ידי לחץ גיסת נוזלים.
