Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur

Dieses Protokoll bietet einen einfachen und schnellen Ansatz, um Kandidaten-Biomaterialtinten vor komplexen 3D-Bioprinting-Experimenten auf mögliche zytotoxische Wirkungen gegen empfindliche Primär- und Immunzellen zu untersuchen. Nach der Inkubation der Immunzellen auf den Biomaterial-Tintenkonstrukten können die Zellen durch sanftes Waschen leicht aus den Konstrukten entnommen werden, um nachgeschaltete Zytotoxizitäts- oder Biomarkeranalysen durchzuführen. Dieses Protokoll ist direkt relevant für das Tissue Engineering, bei dem biogedruckte Gewebe, die für die Transplantation bestimmt sind, aus Primärzellen und biokompatiblen Biomaterialtinten hergestellt werden müssen.

Bereiten Sie zunächst eine Bio-Tintenpatrone für die Installation auf dem INKREDIBLE+3D-Bioprinter vor. Entfernen Sie zunächst die blauen Endkappen von der drei Milliliter großen Biomaterial-Tintenpatrone und befestigen Sie eine sterile konische 22-Gauge-Bioprinting-Düse am Luer-Lock-Ende der Bio-Tintenpatrone. Schließen Sie den Luftdruckzufuhrschlauch für Druckkopf eins oder PH1 an das gegenüberliegende Ende der Patrone an und setzen Sie die Patrone mit der angeschlossenen konischen Bioprinting-Düse in den vertikalen Schlitz von PH1 ein.

Setzen Sie als Nächstes die Patrone fest in PH1 mit einer konischen Bioprinting-Düse ein, die sich unter den Druckkopf erstreckt. Ziehen Sie die Schraube am PH1 im Uhrzeigersinn fest, bis der Finger fest sitzt, um die Bio-Tintenpatrone zu verriegeln. Beachten Sie, dass der 3D-Bioprinting mit ph2 durchgeführt werden kann, der leer bleibt.

Schalten Sie den Bioprinter ein und starten Sie die Bioprinter-Software auf einem PC, der über ein USB 2.0-Kabel mit dem 3D-Bioprinter verbunden ist. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Verbinden, um sie mit dem 3D-Bioprinter zu synchronisieren. Beachten Sie drei Optionen im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Bioprinters.

Bereiten Sie zunächst den Bioprint vor. Zweitens, Dienstprogramme Menü. Und drittens, Statusbildschirm.

Wählen Sie die Option Bioprint vorbereiten aus, scrollen Sie dann nach unten und wählen Sie die Option Home-Achsen aus. Nach erfolgreicher Kalibrierung der XYZ-Achsen sinkt die Höhe des Druckbetts leicht ab und die Druckköpfe verschieben sich über den Mittelpunkt des Druckbetts. Um mit der Ausgangspunktkalibrierung für das Bioprinting in 24-Well-Platten fortzufahren, entfernen Sie eine sterile 24-Well-Kulturplatte aus der versiegelten Plastikverpackung und markieren Sie einen Punkt auf dem Mittelpunkt von Well D1 auf der Unterseite der Platte mit einem Permanentmarker.

Entfernen Sie die Plattenabdeckung und legen Sie die 24-Well-Kulturplatte auf das Druckbett mit der Vertiefung D1 in der vorderen linken Ecke des Druckbetts. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü das Menü Dienstprogramme aus, und verschieben Sie dann die Achse. Bewegen Sie die Druckköpfe in Schritten von einem Millimeter entlang der X- und Y-Achse, bis sich die konische Bioprinting-Düse von PH1 direkt über dem Punkt befindet, der unter vertiefung D1 markiert ist. Passen Sie bei Bedarf die Position der konischen Bioprinting-Düse über dem Punkt ab, indem Sie die Druckköpfe in Schritten von 0,1 Millimetern bewegen.

Zeichnen Sie die X- und Y-Koordinaten der konischen Bioprinting-Düse auf, wenn Sie sich direkt über der Mitte der Vertiefung D1 befinden, wie im Bedienfeldbildschirm des 3D-Biodruckers angegeben, und markieren Sie die Koordinaten. Als nächstes heben Sie das Druckbett in Schritten von einem Millimeter an, bis der Boden der Vertiefung D1 fast die konische Bioprinting-Düse berührt, die im ersten Druckkopf installiert ist. Feinabstimmung der Bewegung des Druckbettes in 0,1-Millimeter-Schritten, falls erforderlich.

Wählen Sie im Dienstprogrammmenü die Option Z-Achsen-Kalibrierung und wählen und bestätigen Sie die Option Z-Kalibrierung speichern. Kehren Sie zum Hauptmenü zurück und wählen Sie die Option Bioprint vorbereiten. Scrollen Sie nach unten zu und wählen Sie die Option Z kalibrieren aus.

Aktualisieren Sie den geometrischen Code der 24-Well-Platte oder den G-Code mit den richtigen Startpunktkoordinaten. Öffnen Sie die mitgelieferte 24-Well-G-Code-Datei in der Bioprint-Software. Aktualisieren Sie die X- und Y-Koordinaten in Zeile eins mit den in den vorherigen Schritten erhaltenen Werten und speichern Sie die Datei unter einem neuen Namen.

Stellen Sie sicher, dass die pneumatische Pumpe fest mit dem hinteren Luftansauganschluss des INKREDIBLE+3D-Biodruckers verbunden ist, und schalten Sie ihn ein. Ziehen Sie den vorderen Steuerknopf auf der rechten Seite des INKREDIBLE+3D-Biodruckers heraus. Stellen Sie sicher, dass die digitalen Manometer für PH1 und PH2, die sich auf der Vorderseite des Biodruckers befinden, jeweils nahezu null Kilopascal lesen.

Drehen Sie den vorderen Steuerknopf langsam im Uhrzeigersinn, bis der auf dem linken Messgerät für PH1 angezeigte Druck 12 Kilopascal erreicht. Legen Sie ein gefaltetes Seidenpapier oder ein Stück wasserdichte Dichtungsfolie unter die Druckdüse der installierten Patrone und achten Sie darauf, die Druckdüse nicht zu berühren. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Bioprinters die Option Bioprint vorbereiten aus.

Navigieren Sie zu PH1 aktivieren, und wählen Sie PH1 aktivieren aus. Beachten Sie, dass die Bio-Tinte aus der Druckdüse zu extrudieren beginnt. Erhöhen Sie bei Bedarf den Extrusionsdruck, indem Sie den Steuerknopf im Uhrzeigersinn drehen, bis die Biotinte in einem kontinuierlichen Filament extrudiert ist, und zeichnen Sie die neue Druckeinstellung auf.

Wählen Sie PH1 deaktivieren, um die Extrusion der Biotinte zu stoppen. Entfernen Sie Seidenpapier oder -folie, die die extrudierte Biotinte enthält, aus dem Druckbett und schließen Sie die Bioprinter-Tür. Um den 3D-Biodruck von geradlinigen Hydrogelsubstraten in einem 24-Well-Plattenformat durchzuführen, wählen Sie das Dienstprogrammmenü aus dem Hauptsteuerungsmenü und wählen Sie dann SD-Druck deaktivieren, damit die Bioprinter-Software G-Code-Dateien zum Drucken an den 3D-Bioprinter übertragen kann.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden in der Bioprinter-Software und wählen Sie die aktualisierte 24-Well-Platten-G-Code-Datei aus. Wählen Sie im rechten Bedienfeld der Software die Registerkarte Druckvorschau und klicken Sie auf die Schaltfläche Drucken, um mit dem Bioprinting in Bohrloch D1 zu beginnen. Nach Abschluss des Bioprintings der geradlinigen Konstrukte decken Sie die 24-Well-Platte mit ihrem Deckel ab und bringen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II. Tauchen Sie jedes geradlinige Konstrukt in zwei Tropfen steriler 50-millimoler Calciumchloridlösung und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Saugen Sie die Calciumchloridlösung vorsichtig aus jedem Bohrlochkonstrukt ab und spülen Sie sie einmal in einem Milliliter 1X PBS ab, um überschüssiges Calciumchlorid zu entfernen. Um eine Austrocknung der biogedruckten Hydrogelkonstrukte zu verhindern, halten Sie die 3D-biogedruckten geradlinigen Konstrukte in frischem 1X PBS, bis die aus dem Knochenmark stammenden Mastzellen bereit sind, auf die Konstrukte gesät zu werden. Basierend auf den Vorwärts- und Seitenstreuparametern der mittels Durchflusszytometrie analysierten BMMCs wurde beobachtet, dass das Hydrogelsubstrat mit der höchsten CNC-Konzentration die native Größe oder Granularität der BMMCs im Vergleich zu den BMMCs, die in Abwesenheit der CNC-Agarose D-Mannitol-Hydrogel-Substrate kultiviert wurden, nicht veränderte.

Die durchflusszytometrische Analyse der Permeabilität der BMMCs gegenüber Propidiumiodid zeigte, dass keine der getesteten CNC-Konzentrationen nachteilige Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von BMMC hatte. Das CNC-Agarose-Substrat erhöhte die Expression der Mastzell-Biomarker bei CNC-Konzentrationen größer oder gleich 2,5%, die Expressionsniveaus dieser Rezeptoren blieben jedoch relativ konstant zwischen 2,5% und 12,5% CNC, was auf einen Effekt hindeutet, der unabhängig von der Konzentration von CNC ist. Der XTT-Assay zeigte, dass die metabolische Aktivität der auf den 3D-biogedruckten Hydrogelgerüsten kultivierten BMMCs über alle getesteten Zeitpunkte hinweg relativ konstant bei etwa 100% blieb.

Ebenso zeigten die LDH-Freisetzungs- und PI-Farbstoffausschluss-Assays keine signifikanten Veränderungen in der Lebensfähigkeit der BMMCs. Sorgfältige Aufmerksamkeit bei der Auswahl des Druckdüsenmessgeräts, der Kalibrierung der Achsen des 3D-Biodruckers und der Extrusionsdruckeinstellung gewährleistet einen reproduzierbaren Druck hochwertiger 3D-Konstrukte. Die Leichtigkeit, mit der die Mastzellen abgerufen werden können, ermöglicht es, sie durch eine breite Palette biologischer Assays zu untersuchen, um jeden Aspekt ihrer zellulären Funktionen weiter zu untersuchen.