Este protocolo oferece uma abordagem fácil e rápida para tela de tintas biomateriais candidatos para potenciais efeitos citotóxicos contra células primárias e imunes sensíveis antes de experimentos complexos de bioimpressão 3D. Após a incubação das células imunes nos construtos de tinta biomaterial, as células podem ser facilmente recuperadas das construções por lavagem suave para realizar análises de citotoxicidade a jusante ou biomarcadores. Este protocolo é diretamente relevante para a engenharia tecidual em que tecidos bioimpressores destinados ao transplante devem ser construídos a partir de células primárias e tintas biocompatíveis de biomateriais.
Para começar, prepare um cartucho de tinta biológica para instalação na bioimpressora INKREDIBLE+3D. Primeiro, remova as tampas de extremidade azul do cartucho de tinta biomaterial de três mililitros e afixe um bocal de bioimpressão cônica estéril de 22 bitolas cônicas na extremidade do bloqueio Luer do cartucho de tinta biológica. Conecte a tubulação de alimentação de pressão de ar para um cabeçotário ou PH1 à extremidade oposta do cartucho e insira o cartucho com o bocal de bioimpressão cônica anexado no slot vertical do PH1.
Em seguida, aposte firmemente o cartucho em PH1 com um bocal de bioimpressão cônico estendendo-se abaixo do cabeçoso de impressão. Aperte o parafuso no ph1 no sentido horário até o dedo apertado para travar o cartucho de tinta biológica no lugar. Observe que a bioimpressão 3D pode ser realizada com PH2 deixado vazio.
Ligue a bioimpressora e inicie o software bioimpressora em um PC conectado à bioimpressora 3D através de um cabo USB 2.0. No software, clique no botão conectar para sincronizá-lo com a bioimpressora 3D. Observe três opções no menu de controle principal da bioimpressora 3D.
Primeiro, prepare a bioimpressão. Segundo, menu de utilidades. E terceiro, tela de status.
Selecione a opção preparar bioimpressão e, em seguida, role para baixo e selecione a opção eixos domésticos. Após a calibração bem sucedida dos eixos XYZ, a altura da cama de impressão diminuirá ligeiramente e as cabeças de impressão se mudarão para acima do ponto central da cama de impressão. Para prosseguir com a calibração do ponto de partida para bioimpressão em placas de 24 poços, remova uma placa de cultura estéril de 24 poços de sua embalagem plástica selada e marque um ponto no ponto central do poço D1 na parte inferior da placa com um marcador permanente.
Retire a tampa da placa e coloque a placa de cultura de 24 poços na cama de impressão com bem D1 localizado no canto esquerdo da cama de impressão. No menu de controle principal, selecione o menu de utilidades e, em seguida, mova o eixo. Mova as cabeças de impressão em incrementos de um milímetro ao longo dos eixos X e Y até que o bocal de bioimpressão cônica do PH1 esteja diretamente sobre o ponto marcado sob bem D1. Se necessário, ajuste a posição do bocal de bioimpressão cônica sobre o ponto movendo as cabeças de impressão em incrementos de 0,1 milímetro.
Registo as coordenadas X e Y do bocal de bioimpressão cônica quando diretamente sobre o centro do poço D1, conforme indicado na tela do painel de controle da bioimpressora 3D e marque as coordenadas. Em seguida, levante a cama de impressão em incrementos de um milímetro até que a parte inferior do poço D1 esteja quase tocando o bocal de bioimpressão cônica instalado em um cabeçote de impressão. Ajuste o movimento da cama de impressão em incrementos de 0,1 milímetro, se necessário.
No menu utilitários, selecione a opção de calibração do eixo Z e selecione e confirme a opção de calibração Z da loja. Retorne ao menu principal e selecione a opção preparar bioimpressão. Role para baixo e selecione a opção calibrar Z.
Atualize o código geométrico da placa de 24 poços ou o código G com as coordenadas corretas do ponto de partida. Abra o arquivo de código G de 24 poços fornecido no software de bioimpressão. Atualize as coordenadas X e Y na linha um com os valores obtidos em etapas anteriores e salve o arquivo sob um novo nome.
Certifique-se de que a bomba pneumática esteja bem conectada à porta de entrada de ar traseira da bioimpressora INKREDIBLE+3D e ligue-a. Puxe o botão de controle para a frente localizado no lado direito da bioimpressora INKREDIBLE+3D. Certifique-se de que os medidores de pressão digital para PH1 e PH2 localizados na frente da bioimpressora cada um leia perto de zero quilopascal.
Gire lentamente o botão de controle dianteiro no sentido horário até que a pressão indicada no medidor esquerdo para PH1 atinja 12 quilopascals. Coloque um papel de tecido dobrado ou um pedaço de filme de vedação impermeável sob o bocal de impressão do cartucho instalado, tomando cuidado para não tocar no bocal de impressão. No menu de controle principal da bioimpressora 3D, selecione preparar bioimpressão.
Navegue e selecione ativar o PH1. Note que a tinta biológica começa a extrusão do bocal de impressão. Se necessário, aumente a pressão de extrusão girando o botão de controle no sentido horário até que a tinta biológica seja extrudada em um filamento contínuo e registe a nova configuração de pressão.
Selecione desativar ph1 para impedir a extrusão da tinta biológica. Remova papel de tecido ou filme contendo a tinta bio extrudada da cama de impressão e feche a porta da bioimpressora. Para realizar a bioimpressão 3D de substratos de hidrogel retilíneo em um formato de placa de 24 poços, selecione o menu de utilidades do menu de controle principal e selecione a impressão SD desativada que permitirá que o software bioimpressora transmita arquivos de código G para a bioimpressora 3D para impressão.
Clique no botão de carga no software bioimpressora e selecione o arquivo de código G de placa de 24 poços atualizado. No painel de controle à direita no software, selecione a guia de visualização de impressão e clique no botão de impressão para iniciar a bioimpressão em bem D1. Após a conclusão da bioimpressão dos construtos retilineares, cubra a placa de 24 poços com sua tampa e mova-a para um armário de biossegurança classe II. Mergulhe cada construção retilíquica em duas gotas de solução estéril de cloreto de cálcio de 50 milômlares e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.
Aspire cuidadosamente a solução de cloreto de cálcio de cada poço construir e enxaguar uma vez em um mililitro de 1X PBS para remover o excesso de cloreto de cálcio. Para evitar a desidratação dos construtos de hidrogel bioimpresso, mantenha os construtos retilinear 3D bioimpressos em 1X PBS frescos até que as células de mastro derivadas da medula óssea estejam prontas para serem semeadas nas construções. Com base nos parâmetros de dispersão dianteira e lateral dos BMMCs analisados pela citometria de fluxo, observou-se que o substrato de hidrogel com maior concentração de CNC não alterou o tamanho ou granularidade nativa dos BMMCs em comparação com os BMMCs cultivados na ausência dos substratos de hidrogel D-mannitol da CNC.
A análise citométrica do fluxo da permeabilidade dos BMMCs ao iodeto de propídio demonstrou que nenhuma das concentrações de CNC testadas provocou qualquer efeito adverso na viabilidade do BMMC. O substrato de agarose CNC aumentou a expressão dos biomarcadores de células de mastro nas concentrações CNC maiores ou iguais a 2,5%No entanto, os níveis de expressão desses receptores permaneceram relativamente consistentes entre 2,5% e 12,5% CNC, o que sugere um efeito independente da concentração de CNC. O ensaio XTT demonstrou que a atividade metabólica dos BMMCs cultivados nos andaimes de hidrogel bioimpresso 3D permaneceu relativamente consistente em cerca de 100% em todos os pontos de tempo testados.
Da mesma forma, os ensaios de liberação de LDH e exclusão de corantes PI não revelaram alterações significativas na viabilidade dos BMMCs. Atenção cuidadosa à seleção do medidor de bocal de impressão, calibração dos eixos da bioimpressora 3D e a configuração de pressão de extrusão garantirá a impressão reprodutível de construções 3D de alta qualidade. A facilidade com que as células de mastro podem ser recuperadas permite que elas sejam sondadas por uma ampla gama de ensaios biológicos para estudar melhor qualquer aspecto de suas funções celulares.
