בניית ממברנות דו-שכבתיות שומנים המתוארות בפרוטוקול זה יכולה לשמש כדי לקבל מידע חיוני על אינטראקציות ממברנה עם סוכני תרופות, רעילים סביבתיים, ואפילו תרכובות ביולוגיות. טכניקות אלה יכולות לשמש כדי לפברק ממברנות של מורכבות נוזלית משתנה, ולהעריך חדירות תרכובת, ספיגה, והטמעה בתוך ממברנות. כדי להתחיל, להוסיף את הנפח המתאים של תמיסת מלאי השומנים לתוך זכוכית נקייה לתפלת כדי להשיג ריכוז ארסיות סופי של 2.5 מיליגרם למיליליטר לאחר rehydration.
הסר כלורופורם מתמיסת השומנים, באמצעות זרם של גז חנקן. כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורופורם, חבר את סרט השומנים המיובש לוואקום במשך ארבע שעות לפחות. Rehydrate סרט השומנים היבש עם נפח נדרש של חוצץ טריס נתרן כלורי כדי להניב את ריכוז ההזרמה הסופי של 2.5 מיליגרם למיליליטר, מערבולת במשך כ 15 עד 30 שניות.
מעבירים את ההשעיה הארסית למיכל עם קרח יבש עד להקפאה של כ-30 דקות. לאחר המדגם קפוא לחלוטין, להפשיר את ההשעיה באמבט מים 30 עד 40 מעלות צלזיוס. מערבולת השעיית ארסיה מופשרת.
כדי להפוך מיליליטר אחד או פחות של שלל, להשיג מחול מיני. יש להרטיב מסנן עם מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן להניח אותו על משטח התמיכה בממברנה בתוך טבעת ה-O. חזור על הפעולה לקבלת התמיכה הפנימית השנייה בממברנה.
מקם תמיכה פנימית אחת בממברנה לתוך המארז החיצוני של המהלומה. הנח קרום פוליקרבונט אחד של 100 ננומטר על התמיכה הפנימית בממברנה ישירות מעל התמיכה במסנן. מקם את התמיכה הפנימית השנייה בממברנה לתוך המארז החיצוני של המהלומה עם טבעת O וסינון צד תמיכה מול קרום פוליקרבונט.
חבר את הפוליטרפלואורואתילן הנושא לתוך קשר שכר הטרחה ובורג אותו סגור עם המארז החיצוני של המכבש. חותכים את המהלל לבלוק החימום. לטעון את ההשעיה השומנים לתוך אחד המזרקים למקם את המזרק לתוך בלוק חום extruder, החדרת המחט באופן מלא לתוך קצה אחד של המכבש.
הכנס את המזרק הריק השני לצד הנגדי ונעל את שני המזרקים באמצעות מהדקי הזרוע על בלוק החום. לאט לאט לדחוף את ההשעיה vesicle לתוך המזרק הריק ולאחר מכן בחזרה למזרק המקורי. חזור על 20 פעמים נוספות עבור סך של 21 עובר דרך קרום פוליקרבונט.
מעבירים את שלל השומנים לשפל זכוכית נקי לאחסון. כדי להבליט חמישה עד 50 מיליליטר של שלל, להרכיב את המבליט הגדול על ידי הצבת התמיכה במסך החור הגדול, דיסק ממורכז, דיסק ניקוז, וקרום פוליקרבונט לתוך החלל בתמיכה התחתונה extruder. חבר את התמיכה העליונה והתחתון באמצעות ארבעת הברגים והידוק.
חבר את יחידת המבליט לצילינדר המדגם על ידי קרצוף זה לתחתית והידוק עם מפתח ברגים כדי לאבטח. מלא את גליל המדגם במים אולטרה-סברים ונווט את המים דרך יחידת האקסטרודר לפני הוספת הדגימה לצילינדר המדגם. מוסיפים את מתלה השומנים לצילינדר המדגם ומברגים את החלק העליון סגור.
לאט להגביר את הלחץ עד המדגם מתחיל לטפטף מיחידת extruder בקצב של כ שתיים עד שלוש טיפות לשנייה לתוך זכוכית נקייה. לאחר כל המדגם כבר extruded, לכבות את אספקת חנקן ולשחרר את הלחץ בצילינדר המדגם על ידי פתיחת שסתום הקלה בלחץ לאט. יוצקים את שלטי השומנים בחזרה לתוך גליל המדגם ולחזור על השלב הקודם תשע פעמים נוספות עבור סך של 10 שחול.
טען את ההשעיה הזרימה לתוך cuvette המתאים, ולהכניס לתוך מכשיר פיזור האור הדינמי, להזין את פרטי המדגם, ולבצע את המדידה באמצעות התוכנה המשויכת. מניחים את תא הזטה בתא הדגימה, ומוודאים שהאלקטרודות נמצאות בקשר, וסוגרים את מכסה מחזיק הדגימה. בתוכנה המשויכת, הזן את הפרטים לדוגמה ואסוף מדידות.
הכנס את חיישן גביש הקוורץ המקודד של סיליקה למודול הזרימה, והבטח שצורת ה- T על הגביש תתיישר עם צורת ה- T במודול ותברג את מודול הזרימה סגור. במכשירים עם תאים מרובים, bilayers נוספים ניתן ליצור במקביל. חבר את הצינורות והשקע למודול הזרימה והמשאבה.
מניחים את הצינורות לתוך שומרי ההחזקה וסוגרים את המכסה של מערכת המנתח. מניחים מיכל פסולת בשקע המשאבה כדי לאסוף פתרונות שהוצאו. כדי לבצע את הניקוי, הפעל תחילה את המשאבה והגדר את מהירות הזרימה ל-400 מיקרוליטרים לדקה.
הכנס את צינורות הכניסה למים טהורים במיוחד ולזרום חמישה עד 10 מיליליטר דרך המודול. החלף צינורות לתוך SDS ולהזרים חמישה עד 10 מיליליטר דרך המודול. מעבירים צינורות בחזרה למים טהורים במיוחד וזורמים 10 עד 20 מיליליטר דרך המודול.
לבסוף, לזרום אוויר דרך המודול עד שלא נאסף פתרון שנותר. הסר את החיישן ממודול הזרימה ושטוף את החיישן במים טהורים במיוחד. כונן החיישן ואת מודול הזרימה עם זרם גז חנקן, מוודא כי האלקטרודה תמיד נשאר ללא כל נוזל.
במכסה המנוע הכימי, הכנס את חיישן גביש הקוורץ מצופה סיליקה למכשיר ניקוי אולטרה סגול או אוזון. הפעל את המכשיר ולאפשר טיפול במשך שתי דקות לפחות. הסר את החיישנים בזהירות והחזר אותם לתוך מודול הזרימה.
הפעל את מכשיר המנתח כדי לחבר את התוכנה המשויכת ולהגדיר את הטמפרטורה לערך הרצוי ליצירת דו-שכבתי השומנים התומך. אפשר לטמפרטורה להתייצב לקלט הרצוי. קבע את תצורת המדידה ומצא את כל תדרי התהודה של החיישן, ופיזור צלילים 3, 5, 7, 9, 11 ו- 13 לפני תחילת המדידה.
אפשר ל-Tris נתרן כלוריד לזרום דרך המודול במשך חמש עד עשר דקות, מה שמבטיח שהשדר הבסיסי ישתנה או דלתא F ושינוי פיזור או ערכי דלתא D בנוזל יישארו יציבים. עצרו את המשאבה, הסירו את צינורות הכניסה מתמיסת טריס נתרן כלורי, והכניסו אותה בזהירות לתמיסת השומנים. זרימה אחורית למשך חמש שניות כדי להסיר את כל בועות האוויר מהצינורות בפרצון, ולאחר מכן להמשיך את הזרימה קדימה.
הפעל מחדש את המדידה בתוכנה כדי לאפס את קו הבסיס. לזרום שלטי שומנים עד היווצרות bilayer הוא ציין בזמן אמת בתוכנה לרכישת נתונים. לאחר מכן חזור על שלב זה כדי לשנות את צינורות ההכנסה של שלל השומנים בחזרה למאגר נתרן כלורי טריס.
הוסף חמישה microliters של פתרון השומנים לתא התורם, שהוא דיפלואוריד פוליווינילידן נקבובי 96 היטב צלחת מסנן רב מסך עם גודל נקבובית 0.45 מיקרו מטר. מיד להטביע את צלחת המסנן לתוך תא הקבלה, שהוא צלחת מקלט תובלה המכיל 300 microliters של תמיסת מלח חוצץ פוספט. הוסף 200 מיקרוליטרים של תמיסת מלח חוצץ פוספט לתא תורם התחבורה.
בצע את השלבים הקודמים של עצירת המשאבה ושינוי צינורות הכניסה לפתרון ארסילי שומנים וצפייה היווצרות bilayer, ולאחר מכן לשנות את צינורות הכניסה לתוך פתרון אלפא הלילי או AH פפטיד. הצג את הפתרון לתוך מודול הזרימה עד שינוי תדירות ושינוי פיזור נצפים מתוספת הפתרון החדשה. עצרו את המשאבה ואפשרו לפפטיד AH לדגור עם שלל במשך 10 דקות.
החליפו את צינורות הכניסה ל-Tris נתרן כלורי, והתחלו את הזרימה כדי להסיר את הפפטיד של AH משלשלות הקרועות, מה שמוביל להיווצרות מוצלחת של דו-שכבתית שומנית. ראשית, להזרים את ממס המולקולה, ולאחר מכן, להעביר את צינורות הכניסה לתוך הפתרון המכיל את המולקולה של עניין ולזרום במשך חמש דקות לפחות. אם תרצה, לעצור את הזרימה ולאפשר לנוזל המכיל את המולקולה הרצויה לדגור עם bilayer.
לשנות את צינורות המפרצון בחזרה לממס המולקולה לבד. לזרום במשך חמש דקות לפחות, ולאחר מכן להעביר את צינורות הכניסה לתוך טריס נתרן כלורי, ולזרום במשך חמש דקות לפחות. בתוכנה, הפסק את המדידה, שמור את הקובץ והפסק את המשאבה.
מיד לאחר שלבים קודמים עבור bilayer מושעה שומנים חד שומנים או עבור bilayer מושעה שומנים מרובים, להסיר PBS מתא צלחת מסנן התורם ולהחליף עם 200 microliters של פתרון הבדיקה. מיד לשקוע בלוח מקלט תחבורה חדש עם 300 microliters של PBS. לאחר דגירה עם נדנדה עדינה במשך שעתיים ב 25 מעלות צלזיוס, לאסוף 150 microliters של הפתרון מן התורם ותאי הקבלה.
מדוד את ריכוז המולקולה בשתי הדגימות בשיטה מתאימה המבוססת על תכונות של מולקולה זו. גודל, polydispersity, ופוטנציאל זטה של שלל מחשב ביצה חד שומנים, ושני הרכבים ארסיות שומנים מרובים הושוו. התפלגות הגודל של שלל מחשב הביצה ושלשלות מרובות שומנים היו כמעט זהות.
שלל אחד מרובה שומנים של ביצים ומחשב אישי טעונים לרעה, בעוד שני שלטי שלטי שומנים מרובים טעונים באופן חיובי. שלפוחיות מחשב ביצה חד-שומנית נספגות בקלות על פני השטח, כפי שמוצג על ידי הירידה בשינוי התדר, ועלייה בשינוי פיזור, ואחריו קרע ספונטני. שלטי שומנים מרובים נספגים על פני השטח, אבל דורשים את התוספת של פפטיד AH כדי לקרוע את שלל, וכתוצאה מכך היווצרות bilayer השומנים.
עם bilayers שומנים נתמכים, שינוי תדירות ושינוי פיזור ניתן לנתח לפני ואחרי הצגת תרכובת של עניין. לדוגמה, אינטראקציות של DEHP ורעיל סביבתי עם חד נתמך ורב שכבתי על ידי שכבות נחקרו. רמות דומות של ספיגת DEHP נצפו עבור שני סוגי bilayer השומנים.
עם זאת, הבדלים בשינוי פיזור נצפו בין bilayers עם שינוי פיזור גדול יותר לראות עבור bilayer PC ביצה לעומת bilayer אחד שומנים מרובים. חלחלה קטנה נצפתה הן עבור דו-שכבתיות חד-שומניות והן עבור שכבות מרובות שומנים. בעקבות הליך זה, ניתן לפתח מגוון של תאים מחקים שכבות שומנים כדי לאפשר הקרנה ללא תאים של אינטראקציות מולקולריות עם תרכובות החל תרופות רעילים סביבתיים.
