המחברים מבקשים להודות תמיכה מהקרן הלאומית למחקר (NRF -NRFF2011-01 וNRF2015NRF-POC0001-19), המועצה למחקר הרפואי הלאומי (NMRC / CBRG / 0005/2012), והאוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג לNJC

1. כינונה של bilayer שומנים הנתמכים על תמיכה מוצקה הידרופילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות שומנים של 10 מ&quot;ג / מיליליטר 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (dOPC) ו1 מ&quot;ג / מיליליטר 1,2-dioleoyl- SN N -glycero-3-phosphoethanolamine- - (rhodamine B lissamine sulfonyl) (Rh-PE) על ידי המסת שומנים אבקות בהתאמה (שקל כראוי מראש עם מאזן מסה אנליטיים) בפתרון isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ולערבב את פתרונות המניות ב isopropanol כדי להכין את תערובת שומנים הרצויה בריכוז הסופי. לניסויי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וFRAP, 0.5% WT Rh-PE צריך להיות כלול בתערובת השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את תערובת השומנים בisopropanol לערוץ microfluidic עד שהוא מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את תערובת שומנים על משטח הזכוכית לכ -10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגה להחליף את פתרון שומנים עם פתרון מים או חיץ באמצעות משאבת peristaltic בקצב זרימה נמוכה מאוד(10-50 μl / min). לחלופין, להחליף את תערובת שומנים על ידי pipetting חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הערוץ באופן יסודי עם חיץ עודף כדי להסיר את isopropanol השייר. </li></ol> 2. כינונה של ממברנות הנתמכות מועשר כולסטרול הערה: המשטח המוצק (SiO 2) תומכת באיחוי שלפוחית, אבל הרכב הקרום (כולסטרול גבוה) מעכב איחוי שלפוחית ​​בגלל שלפוחית ​​מועשרת כולסטרול גבוה כיפוף קשיחות 30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות המכיל שומנים 10 מ&quot;ג / מיליליטר dOPC, 10 מ&quot;ג / מיליליטר כולסטרול, ו1 מ&quot;ג / מיליליטר Rh-PE ידי המסת אבקות בהתאמה הראשונה בisopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.2-1.6 באמצעות פתרונות המניות מוכנים בשלב 2.1. </li></ol> 3. ממברנה נזילות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את שקופיות זכוכית בפתרון נתרן גופרתי dodecyl (SDS) (1%) במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות ביסודיות עם מים ללא יונים ולשטוף שנינותh אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכה יבשה שקופיות באמצעות זרם עדין של חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את השקופיות לפלזמת חמצן במשך 30 שניות בכוח גלי רדיו מרבי בתא הפלזמה חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ציפוי מגן סרט של חדר microfluidic (איור 1 א) המסחרי תחתית באמצעות פינצטה ולצרף את שקופיות זכוכית על הצד הדביק של החדר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את המחברים וצינורות לעמדות כניסה ויציאה של החדר ולמקם את ערוץ microfluidic על הבמה מיקרוסקופ (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופס bilayer שומנים fluorescently שכותרתו נתמכת בערוץ microfluidic [חזור על שלב 1 באמצעות הרכב שומנים הרצוי (למשל, 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר dOPC) כולל 0.5% WT Rh-PE בממס אורגני]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את מטוס bilayer עם מטרת טבילת שמן 60X (NA 1.49) כדי ללכוד תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שתי תמונות מראש אקונומיקה, אז תמונה אקונומיקה 301; מ &#39;נקודה עגולה רחבה עם קרן לייזר mW 532 ננומטר, 100. לפני photobleaching, לחמם את הלייזר עד עוצמתו הפכה יציבה. מייד לאחר photobleaching, ללכוד סדרה של תמונות בכל שנייה 1 למשך 2 דקות כדי לעקוב אחרי ההתאוששות בעוצמת הקרינה במקום מולבן. </li></ol> Assay כימות 4. כולסטרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את מצופה צורן דו-חמצני גבישי קוורץ שבב החיישן לפלזמת חמצן במשך 30 שניות בכוח גלי רדיו מרבי בתא הפלזמה חמצן. הסר את השבב מהאולם והר השבב בתא המדידה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי, לרכוש ראשון תדירות ופיזור של שבב החיישן באוויר על מנת להבטיח הרכבה נכונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למכשיר Q-Sense E1 או E4 QCM-D המסחרי, הפעל את תוכנת Q-רך ולחץ על &quot;רכישה&quot; ובחר &quot;מדידת הגדרות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון החדש שמופיע, בדוק את 3, 5, 7, 9, 11 ו -13 נימות ולאחר מכן לחץ על מצא והפעל על מנת לבדוק את ספקטרום התהודה. הגדר את הטמפרטורה ב 24 מעלות צלזיוס. אם תדרי תהודה אחד או יותר לא מסכימים עם הערכים הצפויים, לבדוק את שבב ההרכבה מחדש לבצע שלב זה עד שיגיע להסכם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל משאבת peristaltic ולזרום פתרון חיץ (10 מ&quot;מ טריס, 150 מ&quot;מ NaCl, pH 7.5) לתוך תא המדידה בקצב זרימה של 100 μl / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, לחץ על &quot;רכישה&quot; ובחר &quot;הפעל מחדש מדידה&quot; על מנת לרשום את אותות פיזור תדר התהודה ואנרגיה. חזור על שלב זה עד תחילת המחקר יציבה מתקבלת עבור משמרות התדירות ופיזור. הערה: צעדים להלן, יהיו משמרות תדירות ופיזור נוספות שניתן להקליט כפונקציה של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק isopropanol (ללא שומנים) במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את התערובת של שומנים / כולסטרול dOPC ביחס טוחנת רצוי עם ריכוז מוחלט שומנים של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר בisopropanol במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק חיץ במשך 20 דקות בקצב זרימה של 100 μl / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרון של 1 מתיל-β-cyclodextrin מ&quot;מ (MβCD) שהוכן במאגר (זרימת 100 μl / min שיעור) עד אות התדר מגיעה לערך יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את משמרות התדר החיוביות ביחס שנגרמת על ידי צעד טיפול MβCD ולחשב את המסה של שומני כולסטרול וdOPC ידי המרת ערכי Δf צ&#39;ו וΔf dOPC לערכי מסה באמצעות משוואת Sauerbrey [Δm = - (ג / n) × Δf, כאשר C = 17.7 ng / 2 סנטימטר, n: נימה]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את החלק יחסי השומה של כולסטרול בSLB, תוך לקיחה בחשבון את המשקל המולקולרי של שומנים dOPC (786.1 g / mol) וכולסטרול (386.6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

בעבודה זו, פרוטוקול ממס מטבע מוצג בי שומנים באלכוהול (isopropanol, אתנול, או n-propanol) מודגרת עם תמיכה מוצקה ולאחר מכן האלכוהול מוחלף בהדרגה עם פתרון חיץ המימי כדי לנהוג בסדרה מעברי שלב ייצור סופו של דבר bilayers שומנים שבשבת-שלב 24. הוא הראה כי השיטה מאפשרת ייצור של bilayers שומנים הנתמכים על משטחים כגון זהב, שהוא בלתי פתיר לשיטת איחוי שלפוחית. טווח ריכוז שומנים בדם אופטימלי (0.1-0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) נקבע להיווצרות bilayer מלאה בפורמטים סטנדרטיים ניסיוניים נבדקו עד כה. בריכוזים שומנים בדם מתחת 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר, תיקונים בדידים, מיקרוסקופיים של bilayers נוצר. מצד השני, בריכוזים מעל 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ונמוך מ -0.5 מ&quot;ג / מיליליטר, bilayer מלא והאחיד נוצר. בריכוזים שומנים מעל לטווח זה, bilayer נוזל עדיין נוצר כverifiאד על ידי ניתוח FRAP, עם זאת, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה הנוכחות של מבני שומנים נוספים בחלק העליון של bilayer. באופן מפתיע, את המורפולוגיה של מבני שומנים נוספים אלה, כפי שנקבע על ידי ניתוח QCM-D, הייתה תלויה באלכוהול שהיה בשימוש בשלב הדגירה. במקרה של אתנול, משמרות F וΔ Δ D גבוהות יחסית דומות חתימת QCM-D המתקבלת לשכבת שלפוחית ​​adsorbed. כאשר isopropanol או n-propanol שימשה במקום, ו Δ היה מעט גבוה יותר מהערך הצפוי לbilayer (ו Δ סופי בין -30 ל -40 הרץ), ואילו Δ D היה ניכר גבוה יותר. תגובות QCM-D כזה יהיו צפויים למבנים מורחבים שומנים (למשל, מיצלות כמו תולעת-) הבולטים החוצה ממשטח הקרום (כגלוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחלק ממקרים). שער חליפי ממס הוא פרמטר חשוב נוסף שיכול להיות קריטי, especially כאשר ריכוזים נמוכים יותר שומנים (למשל, 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר) משמשים. חילופי ממס מהירים בריכוז שומנים בדם נמוך יכולים להוביל להיווצרות של bilayers שלמה. בתא המדידה הסטנדרטי המשמש למדידות QCM-D במאמר זה (קאמרי מדידת Q-Sense E4), ספיקות של כ -100 μl / דקה, היו מתאימים להיווצרות bilayer מלאה מאוד לשחזור. לתאי זרימה בגיאומטריות ונפח אחרים, קצב הזרימה האופטימלי עשוי להשתנות וחייב באופן אמפירי ייקבע על פי הצעדים הציעו במסמך זה. בנוסף ליצירת bilayers שומנים נתמך על משטחים שהם סוררים לאיחוי שלפוחית, יכול להיות מועסק SALB לעקוף את הצורך בשלפוחית ​​שומנים שיכולים להיקרע, ובכך לפתוח את הדלת לייצור של ממברנות נתמכות עם קומפוזיציות מורכבות. כדוגמה להמחשת הרכב, תערובות שומנים בחלק גבוה של כולסטרול נבדקו. כולסטרול הוא מרכיב חשוב של mammעליאן קרום תא, והחלק שלה יכולים להתקרב 45-50% mol של הרכב השומנים קרום (למשל, באריתרוציטים). לכן, גם מודל פשוט של bilayer שומנים המייצגים קרום תא אנושי צריך לכלול כולסטרול. בעוד איחוי שלפוחית ​​יכול לשמש כדי לפברק bilayers השומנים fluidic מכיל כולסטרול רק 10-15%, שיטת SALB מאפשרת היווצרות של bilayers השומנים fluidic מכיל שברים גבוהים של כולסטרול (עד 57% mol, כלכמת ידי מדידות QCM-D) 36. עם זאת, כאשר רמת הכולסטרול הייתה גבוהה עוד יותר (עד 63% mol), תחומים פס-צורה נצפו 37. תחומים קיימים השותף היו נוזליים, מזכיר אלו שנצפו באזור β בתרשים השלב של monolayer כולסטרול / פוספוליפידים בממשק אוויר מים. בסך הכל, שיטת SALB מוצג להיות גישה פשוטה ויעילה ליצירת bilayers שומנים נתמך, במיוחד אנימקרי n מעבר להיקף של שיטת איחוי שלפוחית ​​הקונבנציונלית. עד כה, מיקרוסקופיה הטכניקה וקרינת QCM-D שימשה בעיקר כדי לאפיין את bilayers השומנים הנתמכים נוצרים על ידי שיטת SALB. במבט קדימה, במגוון רחב של טכניקות מדידות אנליטיות משטח רגיש, כוללים תהודת plasmon פני השטח (SPR) 38, במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 39,40, פורייה-להפוך ספקטרוסקופיה אינפרא אדום 41, רנטגן 42 ורפלקטיביות ניטרונים 43 יכול, לשמש כדי להמשיך ולאפיין וללמוד תצורות bilayer פשוטות ומורכבות להכין בשיטת SALB. יכולות אלה מתפתחים לפתוח את הדלת למספר גדול יותר של מדענים שיכולים לחקור קרום תא מלאכותי על ידי ניצול של פרוטוקול ניסוי פשוט וחזק.

Bilayer הנתמך המוצק השומנים 1 (SLB) הוא פלטפורמה רב-תכליתית המשמרת את המאפיינים הבסיסיים של ביו-ממברנות כגון עובי bilayer, diffusivity שומנים דו-ממדי, ואת היכולת לארח מולקולות ביולוגיות הקשורים קרום. בשל המורכבות של קרום תא טבעי, פלטפורמה פשוטה זה הוכחה לתפקד כפלטפורמה יעילה לבדיקות במבחנה של תהליכים הקשורים להיווצרות קרום כמו רפסודה 2, חלבון מחייבת 3, וירוס והחלקיקים דמויי וירוס מחייבים 4,5 , ותא איתות 6. נוצר בסמיכות לתמיכה מוצקה, פלטפורמת SLB תואמת עם מגוון רחב של טכניקות מדידות משטח רגיש כגון מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות הפנימית (TIRF), microbalance-פיזור קוורץ קריסטל (QCM-D), וספקטרוסקופיה עכבה. כמה שיטות פותחו כדי לייצר סוגים שונים של SLBs, כוללים בועות אווירהקריסה 7 ולטבול-עט nanolithography 8 לכתמי submicron בגודל שומנים בדם, 9 לערימות bilayer ואנגמיור-באגט (LB) 10 ואיחוי שלפוחית ​​(VF) 11 למלאים פורש, ציפויי bilayer שומנים חד ציפוי ספין. שיטת VF מורכבת מהספיחה של שלפוחית ​​unilamellar הקטנה לתמיכה מוצקה וקרע ספונטני שלאחר מכן והיתוך ליצירת bilayer שומנים רציף. עם זאת, בתנאים פיסיולוגיים, קרע שלפוחית ​​ספונטנית מוגבל בעיקר לחומרים מבוססי סיליקון כגון דו תחמוצת צורן, זכוכית, ויציצו. בנוסף, קרע שלפוחית ​​אינו מתרחש באופן ספונטני לשלפוחית ​​של קומפוזיציות שומנים מורכבות כגון אלה המכילים שברים גבוהים של כולסטרול או שומנים טעונים שלילי. בהתאם למערכת, קרע שלפוחית ​​עלול להיגרם על ידי התאמה נוספת תנאי הניסוי כגון טמפרטורה 12, pH פתרון 13, ומליחות 14, הלם האוסמוטי 15 </sעד&gt; או לחץ 16, או תוספת של יונים דו ערכיים כגון Ca 2 + 17. לחלופין, פפטיד AH-הקרום פעיל יכול להיות הציג על מנת לערער את יציבות שכבה של שלפוחית ​​adsorbed, שהוביל לקרע שלפוחית ​​והיווצרות bilayer במגוון משטחי 18-22. יתר על כן, היווצרות bilayer מוצלחת דורשת הכנה של אוכלוסייה מבוקרת היטב של שלפוחית ​​unilamellar הקטנה שיכול להיות זמן רב וקשה להשגה ליצירות קרום מסוימות. לכן, למרות יעילותו הגבוהה במקרים אופטימליים (למשל, לאחר טיפול מקדים להקפיא להפשיר נרחב של שלפוחית ​​23), היישום הכללי של איחוי שלפוחית ​​מוגבל על ידי היקף מצעים מתאימים ויצירות קרום. שיטת bilayer שומנים בסיוע הממס (SALB) 24-28 היא טכניקת ייצור חלופית שאינו דורשת שלפוחית ​​שומנים. השיטה מבוססת על o התצהירמולקולות שומנים ו על גבי משטח מוצק בנוכחות של ממס אורגני בליל מים ואחרי חילופי הדרגתיים של ממס זה עם פתרון חיץ המימי כדי לעורר היווצרות SLB. במהלך שלב ממס לבורסה, התערובת משולשת של שומנים, ממס אורגני, ומים עובר שלב מעברי סדרה עם הגדלת חלק מים, מה שמוביל להיווצרות של מבני שלב שבשבת בפתרון התפזורת וSLB על המצע המוצק. חשוב לציין, מסלול הרכבה עצמית זו עוקף את הצורך בקרע שלפוחית, שהיא בדרך כלל הצעד המגביל להפיכתו של שלפוחית ​​adsorbed לSLB. הפרוטוקול חל על מגוון רחב של משטחים הכוללים דו תחמוצת צורן, תחמוצת אלומיניום, כרום, תחמוצת אינדיום בדיל, וזהב. במאמר זה ובוידאו המצורף, השוואה של תצהיר שומנים על ידי SALB ושיטות איחוי השלפוחית ​​מוצגת. בפרט, ריכוז שומנים בדם ההשפעה של פרמטרים ניסיוניים, כולל, קצב זרימה, ואת הבחירה של ממס אורגני בליל מים, על איכות bilayer נוצר על ידי שיטת SALB הם דנו. אפיון אנליטי של SLBs המפוברק מבוצע על ידי QCM-D, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, והתאוששות הקרינה לאחר photobleaching טכניקות (FRAP). ניטור QCM-D הוא טכניקת מדידת מסת משטח רגיש ש, מאז עבודתו החלוצית בניצוחו של קלר וKasemo 29, כבר נעשה שימוש נרחב לחקור היווצרות bilayer כמותית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר בדיקה של הומוגניות קרום, כמו גם להדמיה של תחומים קרום. טכניקת FRAP היא כלי סטנדרטי כדי לקבוע את הניידות לרוחב של מולקולות שומנים בSLB, שהוא רכוש חיוני של קרומי fluidic. החלק הראשון של מחקר זה כרוך ניתוח QCM-D של SALB ושיטות איחוי שלפוחית ​​מיושם לנסות היווצרות bilayer על סיליקון דו חמצני וזהב. בחלקו השני,ההכנה והאפיון של קרומים נתמכים המכילים מגוון רחב של ריכוזי כולסטרול בשיטת SALB הם הפגינו והתוצאות בהשוואה לאלו שהושגו בשיטת איחוי שלפוחית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

כדי לחקות קרום תא, bilayer תמך השומנים (SLB) הוא פלטפורמה אטרקטיבית המאפשרת בחקירת מבחנה של תהליכים הקשורים קרום תוך הענקת התאמה ביולוגית וbiofunctionality למצעים מוצקים. הספיחה והקרע הספונטנית של שלפוחית ​​פוספוליפידים הוא השיטה הנפוצה ביותר ליצירת SLBs. עם זאת, בתנאים פיסיולוגיים, איחוי שלפוחית ​​(VF) מוגבל לרק קבוצת משנה של קומפוזיציות שומנים ותומכים מוצקים. כאן אנו מתארים הליך כללי צעד אחד נקרא שיטת היווצרות bilayer שומנים בסיוע ממס (SALB) כדי ליצור SLBs אשר אינו דורש שלפוחית. שיטת SALB כרוכה בתצהיר של מולקולות שומנים על גבי משטח מוצק בנוכחות ממסים מים בליל אורגני (למשל, isopropanol) וממס מטבע הבא עם פתרון חיץ המימי כדי לעורר היווצרות SLB. צעד חילופי הממס הרציף מאפשר יישום שלשיטה בתצורת זרימה דרך מתאימה להיווצרות bilayer ניטור ושינויים שלאחר מכן באמצעות מגוון רחב של חיישני משטח רגיש. שיטת SALB יכולה לשמש כדי לפברק SLBs על מגוון רחב של משטחים מוצקים הידרופילי, כוללים אלה שהם סוררים לאיחוי שלפוחית. בנוסף, היא מאפשרת ייצור של SLBs המורכב מיצירות שומנים שלא יכול להיות מוכן תוך שימוש בשיטת איחוי שלפוחית. בזאת, אנו להשוות את התוצאות שהושגו עם שיטות איחוי שלפוחית ​​SALB וקונבנציונליות על שני משטחים הידרופילי המחשה, דו תחמוצת צורן וזהב. כדי לייעל את תנאי ניסוי להכנת bilayers באיכות גבוהה שהוכנה באמצעות שיטת SALB, את ההשפעה של פרמטרים שונים, כוללים הסוג של ממס אורגני בצעד התצהיר, שערי מטבע ממס, וריכוז השומנים נדונה יחד עם עצות לפתרון בעיות . היווצרות קרום נתמך המכיל שברים גבוהים של כולסטרול היא גם שדיםtrated עם שיטת SALB, המדגיש את היכולות הטכניות של טכניקת SALB למגוון רחב של תצורות קרום.

Watch this Scientific Journal Video about Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method at JoVE.com

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

אנו מציגים פרוטוקול ניסוי ליצירת bilayer שומנים נתמך על מצעים מוצקים ללא שימוש בשלפוחית ​​שומנים. אנו מדגימים שיטת צעד אחד כדי ליצור bilayer שומנים על סיליקון דו חמצני וזהב, כמו גם קרומים נתמכים עם תחום מועשר כולסטרול עבור יישומים ביולוגיים שונים.

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.6K Views.  Nanyang Technological University.  אנו מציגים פרוטוקול ניסוי ליצירת bilayer שומנים נתמך על מצעים מוצקים ללא שימוש בשלפוחית ​​שומנים. אנו מדגימים שיטת צעד אחד כדי ליצור bilayer שומנים על סיליקון דו חמצני וזהב, כמו גם קרומים נתמכים עם תחום מועשר כולסטרול עבור יישומים ביולוגיים שונ?...

Video: Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

ייצור מערך microneedle פולימרית יתוגרפיה

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

שיטת ייצור פשוט Scalable עבור מכשירים אלקטרוניים אורגניים על טקסטיל

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...