המיקרוסקופיה מבוססת על בדיקות כדי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE. אלה מלנוציטים מעור. האברונים בצבע שחור שרואים בתוך התאים נקראים מלנומוזומים.
מלנוזומים ידועים כמעמד של אברונים הנקראים אברונים הקשורים לליזוזום או LRO. מיחזור אנדוזומים הם אברונים אופניים צינוריים מתחילת או מיון אנדוזומים בכל סוגי התאים. אברונים אלה ממלאים תפקיד מפתח בביוגנזה של מלנוזומים, אברון הקשור ליזוזום המיוצר על ידי מלנוציטים.
אנדוזומים למיחזור מספקים את המטען הספציפי למלנוציטים למלנוזומים מוקדמים במהלך היווצרותם. הדור של אנדוזומים מיחזור שנצפו במספר תסמונות הוא תאים היפרפיגמנטציה של העור, השיער, והעין. לכן, לימוד הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים שימושי כדי להבין את הפונקציה של אברונים אלה במצבים נורמליים ומחלות.
מחקר זה נועד למדוד את הדינמיקה של אנדוזומים מיחזור באמצעות עצירת תחביר SNARE-13. הצעד הראשון הוא זריעת מלנוציטים של עכברים על כיסויים שטופלו מראש. מצפים את כיסויי הזכוכית בצלחת פטרי במדיום מטריצת הממברנה במרתף.
ולייבש אותו במכסה המנוע תרבית הרקמות במשך 15 דקות. יש לשטוף את כיסויי הכיסוי פעם אחת עם 1X PBS לפני השימוש. זרע את התאים על קרום המרתף כיסויים מצופים בינוניים ב 50 עד 60% כשירות.
תמיד להוסיף 200 nanomolars של PMA השעיית תא מצופה במדיה RPMI מלאה. לאחר זריעת התאים, לדגור על המנה המכילה תאים באינקובטור CO2 במשך 12 עד 24 שעות. השלב השני הוא טרנספקטציה של תאים עם תחביר-13 פלסמידים.
לדגור על הטיפים המכילים DNA ריאגנט transfection, לערבב במשך חמש דקות ומערבבים ללא pipetting חוזר. הקש על הצינור ביד כל עשר דקות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS, פעם אחת עם OPTI-MEM, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליון של OPTI-MEM לתאים.
לאחר 30 דקות של דגירה, להוסיף את תערובת DNA ריאגנט transfection לתאים בצורה טיפה חכם על ידי כיסוי המנה. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. שאפו את המדיום OPTI-MEM עם ריאגנט transfection ולהוסיף מדיום RPMI מלא בתוספת 200 nanomolars של PMA.
לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. השלב השלישי הוא קיבעון התאים. אנא שימו לב כי ההליך הבא מתבצע מחוץ למכסה המנוע של תרבית הרקמות.
לאחר 48 שעות של טרנספקטציה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS ולאחר מכן לתקן את התאים עם 3%פורמלדהיד במשך 30 דקות. לאחר קיבעון, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS ולאחסן את כיסויים ב 1X PBS עד לשימוש נוסף. לחלופין, תאים יכולים להיות מותקנים על לוחות זכוכית או מאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס.
השלב הרביעי הוא חיסון התאים. הכן תא לח. מניחים חתיכת חיתוך פרפילם על נייר מסנן עכברים בצלחת פטרי.
מכסים בנייר אלומיניום. הכן 25 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים העיקרי. הוסף נוגדן בדילול של אחד עד 200.
הוסף פתרון זה כטיפה על parafilm בתא לח. הרימו בזהירות את כיסוי המכסה במלקחיים. הפוך אותו על טיפה של פתרון כתמי נוגדנים ראשוניים, ולאחר מכן לכסות את המכסה של התא לח.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. באופן דומה, להכין את פתרון הנוגדנים המשני בדילול של אחד עד 500 ולהניח אותו על parafilm ליד כיסוי בתא לח. להכתמת הגרעין, הוסף DAPI בדילול של 120, 000 עד 130,000 לפתרון.
בעזרת מלקחיים, הרימו בזהירות את כיסוי הכיסוי מתמיסת הנוגדנים העיקרית וטבלו אותו פעמיים ב-PBS 1X. הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי. מניחים אותו על תמיסת כתמי הנוגדנים המשנית בתא הלח ואינם חושפים אותו לאור, בשל נוכחותם של נוגדנים צבועים פלואורסצנטית בתמיסה.
לאחר הדגירה, הרימו בזהירות את כיסוי הכיסוי מתמיסת הנוגדנים המשנית ולאחר מכן טובלים אותו פעמיים ב- PBS 1X. יתר על כן, הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי. מניחים 12 מיקרוליטרים של ריאגנט הדמיה על מגלשת זכוכית ומניחים בזהירות את כיסוי הויטראז' על ריאגנט הרכבה.
הפוך את שקופית הזכוכית על נייר הטישו ולאחר מכן לחץ בעדינות. לאחר מכן, צלם את כיסוי הכיסוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומנתח את התמונות באמצעות ImageJ. השלב השישי הוא כימות החפיפה בין המיחזור חלבונים מקומיים אנדוזומים ומלנוזומים.
כימות תחביר-13 דלתא-129 colocalization עם מלנוסומים. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של syntaxin-13 במלנוציטים מסוג בר עכברים הראתה GFP-syntaxin-13 מסוג בר לוקליזציה כמבנים ארסקולריים וצינוריים. ו- GFP-syntaxin-13 delta-129 לוקליזציה של מבנים דמויי טבעת בנוסף לפני השטח של התא.
יתר על כן, טבעת תאית דמוית GFP-syntaxin-13 דלתא-129 הראה colocalization עם חלבון מלנום TYRP1 במלנוזומים בתמונה שדה בהירה. כפי שמוצג קודם לכן, קבוצה של סוג בר GFP-syntaxin-13 בביטוי יתר נצפתה במלנוסומים. כדי למדוד את הלוקליזציה היחסית של סוג כללי של תחביר-13 ו- GFP-syntaxin-13 delta-129 למלנוזומים, נעשה שימוש בתוכנת פיג'י וניתוח נעשה עם תוסף JACOP.
מקדם החפיפה של מנדר הנמדד, כלומר MOC, בין GFP-syntaxin-13 delta-129 עם TYRP1 גבוה בכ-1.5 לעומת סוג פראי GFP-syntaxin-13 עם TYRP1. מעניין, TYRP1 הראה 2.9 מקפלים ערכי MOC גבוהים יותר עם GFP-syntaxin-13 delta-129 בהשוואה לסוג פראי GFP-syntaxin-13. נתונים אלה מצביעים על כך שהלוקליזציה של מלנומוזומים דלתא-129 של GFP-syntaxin-13 גבוהה יחסית לסוג הבר GFP-syntaxin-13 במצב יציב.
כימות של לוקליזציה מסוג בר של תחביר-13 של אנדוזומים למיחזור. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של סוג בר GFP-syntaxin-13 הראתה colocalization עם חלבון אנדוסומאלי מיחזור ידוע Rab11. ה- MOC בין סוג הפרא GFP-syntaxin-13 עם mCherry-Rab11 גבוה בכ-1.4 לעומת mCherry-Rab11 עם סוג פראי GFP-syntaxin-13.
כדי למדוד את המספר והאורך של GFP-syntaxin-13 סוג פראי טוביות אנדוסומליות חיוביות, תוכנת פיג'י שימשה כמתואר בסעיף הפרוטוקול. mCherry-Rab11 משמש שליטה חיובית בניסויים. מלנוציטים שהודבקו בסוג בר GFP-syntaxin-13 הראו מספר גבוה יותר של צינורות לתא בהשוואה לתאים המבטאים mCherry-Rab11.
עם זאת, הצינורות מצטמצמים על שיתוף פעולה של סוג בר GFP-syntaxin-13 ו mCherry-Rab11 בתאים. השלב השביעי הוא כימות המספר והאורך הצינוריים של אנדוזומים. הצינורות מצטמצמים על דו-קיום של סוג הבר GFP-syntaxin-13 ו mCherry-Rab11 בתאים.
מעניין, אורך הצינור הממוצע הן מסוג GFP-syntaxin-13 והן mCherry-Rab11 דומה זה לזה בתאים המבטאים בנפרד או יחד. יחד, נתונים אלה מראים כי GFP-syntaxin-13 סוג בר לוקליזציה למיחזור אנדוזומים דומים Rab11. מחקר זה הראה כי משלוח N-מסוף של מוטציה syntaxin-13, כלומר GFP-syntaxin-13 דלתא-129, לוקליזציה למלנוזום GFP-syntaxin-13 דלתא-129 יכול לשמש ככתב לסחר ברכבים ממחזור אנדוזומים אל פני התא ו- LRO.
לעומת זאת, סוג בר GFP-syntaxin-13 לוקליזציה למיחזור אנדוזומים דומים Rab11. מחקר זה המחיש כי סוג בר GFP-syntaxin-13 יכול לשמש גם לסימון אנדוזומים מיחזור במלנוציטים. סוג פראי GFP-syntaxin-13 עשוי להיות סמן אנדוסומאלי מיחזור טוב יותר מאשר Rab11, שכן Rab11 משנה את הדינמיקה האנדוסומית.
בסך הכל, סוג הבר GFP-syntaxin-13 פועל סמן אנדוסומאלי מיחזור פוטנציאלי כדי ללמוד את הדינמיקה בתנאי מצב יציבים.
