Name: measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2017-09-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

אנו מודים ד ר יונג-לינג ז'ו על מתן לבנות synaptophysin-pHluorin2x, ד ר ג'יימס דגלס רוטמן על מתן VAMP2-phluorin. אנו מודים ד ר סוזן נג ו וירג'יניה קרוקר NINDS מיקרוסקופ אלקטרונים מתקן על תמיכה טכנית ועזרה שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ תוכנית מחקר מגזר בארה ב, מענק של KRIBB המחקר יוזמת התוכנית (קוריאנית ביו מדען תכנית העמיתים), המכון הקוריאני לחקר של Bioscience, ביוטכנולוגיה/ביולוגיה, הרפובליקה של קוריאה.

הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את שיטות הדמיה pHluorin ופעולות EM בשימוש נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית. pHluorin צגים שלפוחית סינפטית חלבון ספיגת בתאים חיים ו- EM מזהה ספיגת של שלפוחית סינפטית, השינויים ultrastructural.
 טיפול בבעלי חיים, הליך עקב הנחיות NIH, אושרו על ידי NIH חיה טיפול ועל שימוש הוועדה.
 1-pHluorin הדמיה <ol><li>נוירון בהיפוקמפוס תרבות <ol><li>הכן ההיפוקמפוס מאגר (HB) על ידי שילוב של 4 מ"מ NaHCO 3 ו 5 מ מ HEPES ולהתאים את ה-pH 7.3 עם 5 M NaOH. להפוך את המדיום התרבות על ידי ערבוב neurobasal בינוני, 2% B27, 0.5 מ מגלוטמין ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. בנוסף, להכין תערובת של המאגר על בסיס חצי פנסיון עם 20% סרום שור עוברית (HB/20% FBS). 
		הערה: פרוטוקול culturing זה מבוסס על Sankaranarayanan, et al. 29 ו וו ואח ' 24</li> <li>לערוף הגורים העכבר בין יום כמחנכת 0 ליום 2 לתוך תרבות בינוני, ולחלץ את המוח לתוך 4 ° C HB/20% FBS. להסיר את גזע המוח תלמוס לחשוף את hippocampi. שווייץ hippocampi, לאחר לחשוף אותה על ידי הסרה של גזע המוח, תלמוס, ולהעביר טרי 4 ° C HB/20% FBS. 
		הערה: בדרך כלל, התשואה הוא בסביבות 4 x 10 5 תאים/mL עבור גור אחד (שני hippocampi). תנקה הקרומים adhering באמצעות פינצטה או מספריים, ולאחר מכן להעביר את טרי 4 ° C HB/20% FBS. לפרוש הכישור משוננת, לבודד את subiculum על ידי גזירה במספריים ולאחר מכן להעביר את טרי 4 ° C HB/20% FBS.</li>
		<li>לחלק כל ההיפוקמפוס, על ידי חיתוך מקצה לקצה, כ- 10 פרוסות ולהעביר אותם צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל.</li>
		<li>לאחר המאפשר הרקמה להתיישב, לשטוף עם 10 מ"ל של HB/20% FBS, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 10 מ"ל של HB-</li>
		<li>להכין תמיסת עיכול 137 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 7 מ מ Na2HPO 4 ו- 25 מ מ HEPES, ולהתאים את ה-pH 7.2 עם 5 M NaOH. הסר את תגובת שיקוע hippocampi. להוסיף 10 מ ג של טריפסין 1 מ ג של DNase 2 מ"ל של פתרון מערכת העיכול, לסנן דרך קרום מיקרומטר 0.22 סטרילי ישירות על גבי בגדר דגימה.</li>
		<li>דגירה של hippocampi עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של HB/20% FBS, ולאחר מכן לשטוף פעם עם 10 מ"ל של HB-</li>
		<li>מביצועם התאים עם 6 מ ג של MgSO 4 &#8729; 7 שעות 2 O ו- 1 מ ג של DNase 2 מ"ל על בסיס חצי פנסיון, מסנן סטרילי אל hippocampi גלולה דרך מסנן מיקרומטר 0.22 סטרילי. בעדינות מביצועם בתאים על-ידי triturating זהירה, תוך דאגה שלא להעלות בועות אוויר. לאפשר רקמות חלקיקים להתיישב למשך 2 דקות, ולאחר מכן להעביר את תגובת שיקוע צניעותו עוד לאט.</li>
		<li>להוסיף 3 מ"ל HB/20% FBS עד תא ההשעיה, וגם צנטריפוגה או 10 דקות ב 4 ° C ו- 1000 סל ד. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תרבות בינוני.</li>
		<li>צלחת 60,000 תאים מושעה במדיום תרבות µL 150-coverslip בקוטר 25 מ מ פולי-D-ליזין מצופה, מבלי לשפוך את coverslip. להוסיף 2 מ של תרבות מראש ומחוממת בינוני 2 h לאחר ציפוי. Coverslips מתוחזקים טוב 6 צלחות culturing או עקר פטרי.</li>
		<li>שמור על תאים ב- 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 humidified חממה במדיום תרבות עבור 14-21 יום לפני ההקלטה. במהלך הגידול תרבות, לשנות את החלק העליון של המדיום פעמיים בשבוע.</li>
	</ol></li> <li>תרביות תאים <ol><li>6-7 ימים לאחר ציפוי, transfect synaptophysin-pHluorin 2 X (SpH) או VAMP2-pHluorin לתוך נוירונים בהיפוקמפוס. לשימוש SpH, מקדם Cytomegalovirus (CMV), מוכנס לתוך וקטור pcDNA3 30. לשימוש VAMP2-pHluorin, מקדם CMV מוכנס לתוך וקטור pCI 31.</li>
		<li>Transfect או וקטור על-ידי השומנים ההובלה לתוך תאי היעד, באמצעות µg 1 של פלסמיד. השתמש בינוני תרבות משלב פרוטוקול 1.1.1, אשר חסרה סרום, עבור תרביות תאים. לשנות את המדיום 2 h לאחר תרביות תאים כדי להפחית רעילות. 
		הערה: במקרה של ביטוי נמוך של SpH עם העיתון ons, להגדיל את ריכוז הדנ א 2 µg או זמן הדגירה עם ההובלה השומנים, אלא אם כן התאים הם לא בריאים. בדרך כלל, 4-10 תאים (0.006-0.008%) של נוירונים היו transfected.</li>
	</ol></li> <li>מיקרוסקופ אור <ol><li>להכין תמיסת מלח רגיל מורכב 119 מ מ NaCl, 2 מ מ CaCl 2, 2.5 מ מ אשלגן כלורי, 25 מ מ HEPES (pH 7.4), גלוקוז 30 מ מ, 2 מ מ MgCl 2, (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione 0.01 מ מ CNQX), ו 0.05 מ"מ חומצה DL-2-אמינו-5-phosphonovaleric (AP5). קח coverslip מן צלחת בינונית תרבות המקום על חדר הדמיה המאפשרת גירוי שדה, באמצעות חומר סיכה, איטום כדי למנוע דליפות. להימנע לתת הזכוכית יבש במהלך ההעברה של coverslip מהצלחת אל התא על-ידי הוספת מיד 750 µL רגיל תמיסת. 
		הערה: CNQX ו- AP5 שימשו כדי לחסום פעילות postsynaptic, אשר יש הפוטנציאל לפעילות חוזרים ונשנים. לפני הצבת תא במיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה, השתמש ניקוי רקמות כדי לאשר כי החדר אינה דולפת. דליפה איטית גורמת מוקד משתנה במהלך ההקלטה על-ידי ערבוב רגיל שמן תמיסת מלח ו טבילה, אשר גורמת לשינויים במדד השבירה.</li>
		<li><ol><li>התמונה במיקרוסקופ widefield הפוכה עם 60 X (מפתח נומרי 1.4) שמן טבילה גירוי והקלטה עדשה עם הליד. דמיינו pHluorin עם מסנן של עירור שיא של 480 ננומטר, מראה מעבר ארוך 490 nm, 500-550 ננומטר מסנן פליטה, תריס היפוך ידני. לכידת תמונות כל 100 ms, עם 2 x 2 binning, באמצעות מצלמת אלקטרון הכפלת חיוב מצמידים התקן (EMCCD). 
			הערה: מספר תכונות נחשבות כדי להשיג את תנאים נאותים כדי להימנע photobleaching, כולל את מרווח לכידת התמונה, ולסנן, binning, אשר תלויות על ציוד. במקרה של הדמיה קונאפוקלית, כוח לייזר וזמן חשיפה להתייחס כדי להימנע photobleaching. הגדרת נקבע לאחר הקלטת לפחות 3 דקות ללא גירוי, ההקלטה בוצעה במשך לפחות 10 s ללא גירוי לבדיקת photobleaching.</li>
			<li>לבחור אזור עם צפיפות גבוהה עם העיתון ons כדי להקל על ניתוח של ניסוי. לזהות תאים transfected לפי האות שלהם פלורסצנטיות ירוק, עם דגש על דפוסי ביטוי עגולים או אליפטיים בוטון, ביטוי רציף בין עם העיתון ons-</li>
			<li>אנדוציטוזה Induce על ידי גירוי שדה משתמש 1 ms הדופק, 20 מא פוטנציאל הפעולה (AP) מכרטיס ממריץ את הדופק ומסר דרך אלקטרודת פלטינה בתוך יחידת בידוד הגירוי. תמונת פעילות זריחה במהלך הגירוי ובמהלך השחזור תא. 
			הערה: במקרה של תאים מתים, הביטוי היה חזק יותר לחיות עם העיתון ons והראה תבנית אחידה בין עם העיתון ons-</li>
		</ol></li></ol></li> <li>ניתוח תמונות <ol><li>לניתוח עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב בוטון יחיד, הגדר את אזור של הריבית (ROI) 1.5 x 1.5 מיקרומטר מרובע; הגודל של בוטון הוא בתוך כ 1.5 שימוש עקבות מיקרומטר. לפני גירוי כדי לבדוק photobleaching וכדי להפחית כרקע.</li>
		<li>קרינה פלואורסצנטית Normalize לשנות (ΔF) עם המשוואה: <img alt="Equation" height="11" src="/files/ftp_upload/55862/55862eq1.jpg" width="172" /> איפה F max ו- F 0 להפנות הגדלה מקסימלי לאחר גירוי ו בסיסית פלורסצנטיות, בהתאמה. למדוד אנדוציטוזה המחירים כמו שיעור הריקבון במהלך הראשון 4-10 s לאחר נקודת מקסימום של זריחה pHluorin. לקבל את קבוע הזמן (τ) של אנדוציטוזה על-ידי התאמת את העששת זריחה pHluorin מהגידול שיא לקו הבסיס עם פונקציה מעריכית-מונו-</li>
	</ol></li></ol> 2. מיקרוסקופ אלקטרונים <ol><li>הכן פולי-D-ליזין מצופה 6-ובכן צלחת על ידי החלת 1.5 מ של 0.01% סטרילי-מסוננים פולי-D-ליזין פתרון כל טוב של h 1 בטמפרטורת החדר, ואז כביסה שלוש פעמים עם מים מעוקר. לנתח, תרבות ולתחזק נוירונים בהיפוקמפוס כמו שלבים 1.1.1, 1.1.2 ו 1.1.3, בהתאמה.</li>
	<li>להכין פתרון גבוהה של גירוי K + עם HRP בתור מ מ 31.5 NaCl, 2 מ מ CaCl 2, 90 מ מ אשלגן כלורי, 25 מ מ HEPES (pH 7.4), גלוקוז 30 מ מ, 2 מ מ MgCl 2, 0.01 מ מ CNQX, מ מ 0.05 AP5 ו 5 מ"ג/מ"ל HRP, ואז להסתגל pH 7.4 עם 5 מ' NaOH.
	פתרון גירוי K + <ol><li>Stimulate התרבות נוירון בהיפוקמפוס 1.5 מ ל גבוהה בטמפרטורת החדר (המכונה K +) על ידי תוספת של 1.5 מ"ל עד מכל קידוח עבור 90 s. במצב מנוחה (המכונה R), להחיל ריכוז זהה של 5 מ"ג/מ"ל HRP עבור 90 s, אבל עם תמיסת מלח רגיל. עבור המדגם השחזור, להחיל פתרון גירוי K + גבוהה כמו עם הדגימה K +, ואז במהירות לשטוף להחליף את המשאבה ואת תקופת דגירה של 10 דקות</li>
	</ol></li> <li>קיבעון, צביעת <ol><li>להכין 0.1 M-Na-cacodylate-מאגר באמצעות נמצא 21.4 g/L cacodylate נה ב- pH 7.4. לתקן תאים עם 4% גלוטראלדהיד במאגר 0.1 M נה cacodylate במשך לפחות שעה בטמפרטורת החדר. תשטוף שלוש פעמים עם 0.1 M נה cacodylate מאגר למשך 7 דקות כל אחד.</li>
		<li>פתרון Diaminobenzidine להכין (DAB), המורכב 0.5 מ"ג/מ"ל של כי אמחה קלות עם 0.3% 2 O H 2 ב- ddH 2 O ומסנן עם מסנן מיקרומטר 0.22. להחיל פתרון DAB 1.5 mL למשך 30 דקות בשטיפת 37 מעלות צלזיוס. שלוש פעמים עם 0.1 M נה cacodylate מאגר למשך 7 דקות כל אחד. 
		התראה: DAB הוא קרצינוגן רעיל, החשודות. נא להשתמש בכפפות עור חלוקי מעבדה. 
		הערה: תיוג עם DAB מתרחשת עקב חמצון שלו על ידי H 2 O 2, כמו על ידי HRP. עליות קטנות הרכיבים לגרום אות מוגבר במדגם. הגדלת ריכוז HRP מאיץ את ההשפעה של הזרז. ריכוז גדול מספיק של 2 O H 2 לאפשר מתישה ריאקציות צדדיות עם HRP, מעכב את השפעת תיוג 32. בעבודה זו, ריכוזי מערכת תיוג זו נבחרו בהתבסס על המחקר זמין כעת 33 , 34-</li>
		<li>דגירה הנוירונים 1.5 מ של 1% OsO 4 במאגר 0.1 M נה cacodylate עבור h 1 ב 4 ° C כמו פוסט קיבעון. תשטוף שלוש פעמים עם 1.5 מ ל 0.1 M נה cacodylate מאגר למשך 7 דקות כל אחד. 
		התראה: בשל רעילות תגובתיות של OsO 4, בשמירה על המדגם על הקרח ברדס כימי עדיפה במקרים רבים על שימוש מקרר עבור הדגירה.</li>
		<li>הכנת 0.1 M סודיום אצטט מאגר עם 13.61 g/L סודיום אצטט ו 11.43 mL/L חומצה אצטית ב- pH 5.0. שלוש פעמים עם מאגר אצטט 0.1 M 1.5 מ ב- pH 5.0 למשך 7 דקות כל וקונטה דגירה עם 1.5 מ ל 1% uranyl אצטט במאגר אצטט 0.1 M ב- pH 5.0 עבור h 1 ב-4 ° C. שטיפת שלוש פעמים עם 1.5 mL 0.1 M אצטט מאגר למשך 7 דקות כל.</li>
	</ol></li> <li>אפוקסי הטבעה <ol><li>מייבשים את התרבות נוירון עם mL 1.5 יחיד שוטף של 50%, 70% ו- 90% אתנול, במשך 7 דקות בכל אחד, ואז 3 שוטף של 1.5 מ"ל אתנול 100% למשך 7 דקות כל אחד בשכונה fume.</li>
		<li>מיקס 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) אפוקסי שרף, 160 מ ל/L dodecenyl סוקסינית אנהידריד (DDSA), 340 מ ל/L Methyl-5-Norbornene-2, 3-Dicarboxylic אנהידריד (NMA), ו- 15 מ"ל/L 2,4,6-טריס (dimethylaminomethyl) פנול (DMP-30) כדי ליצור את אפוקסי שרף. לערבב ביסודיות, מכן לאחסן תחת ואקום להסיר בועות אוויר. 
		הערה: זה קריטי כדי להסיר בועות אוויר שרף, במיוחד אלה קטנים יותר גלוי לעין, כי הם יכולים לגרום חללים שרף במהלך חלוקתה.</li>
		<li>לחדור הדגימה על-ידי החלפת האתנול עם 50% אפוקסי שרף אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מטרף, ולאחר מכן 70% אפוקסי שרף אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מטרף.</li>
		<li>מתג האפוקסי שרף פתרון עם שרף אפוקסי 100%, תקופת דגירה של 10 דקות ב- 50 מעלות צלזיוס לבצע שתי החלפות של שרף אפוקסי 100% טרי עם incubations עבור h 1-50 מעלות צלזיוס. הוסף טריים 100% אפוקסי שרף ולאפשר להקשיח 50 ° C בלילה ולאחר מכן 60 & #17 6; C עבור מעל 36 h להקשיח.</li>
	</ol></li> <li>להסיר כל מדגם מהצלחת מוטי-ובכן עם צורף &#39; s חלול. בחר אזורים מעניינים, ריכוזים צפופים של תאים, באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך, ולאחר מכן לחתוך 70-80 ננומטר בלוקים חלוקתה מאת מיקרוטום. הר האזור לחתוך צ'אק מיקרוטום וטען את האזמל הקטן. מקם את הצ'אק ב האזמל הקטן והר סכין יהלום עם הקצה במקביל למשטח של הרחוב. אוסף קטעים של 70-80 ננומטר בעובי ישירות על גבי רשתות נפרדות.</li>
	<li>לפזר uranyl אצטט למים פתרון 1% לפי משקל, בנפרד להמיס עופרת ציטראט למים פתרון 3% לפי משקל. Counterstain הסעיפים על ידי צלילה עם אצטט uranyl מימית 1% למשך 15 דקות ולאחר מכן 3% עופרת מימית ציטראט למשך 5 דקות לשפר את הניגודיות של הדגימות.</li>
	<li>EM הדמיה <ol><li>לבחון את הסעיפים עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים ותמונות הרשומה עם מצלמה דיגיטלית CCD בהגדלה גדולה העיקרי של 10,000-20, 000 X 3.</li>
	</ol></li> <li>סטטיסטיקה <ol><li>לבצע t-test כדי לזהות הבדלים משמעותיים על-ידי השוואת את שגיאת תקן של מדידה (s.e.m.) וב בין בקרה ניסויית דגימות.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).</li><li>Sun, T., Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcium/calmodulin-activated+calcineurin+in+rapid+and+slow+endocytosis+at+central+synapses.">The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses.</a> J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).</li><li>Wu, X. -. S. S., Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Is+Crucial+for+All+Kinetically+Distinguishable+Forms+of+Endocytosis+at+Synapses.">Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses.</a> Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).</li><li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses.">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).</li><li>Atluri, P. P., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+synaptic+vesicle+reacidification+at+hippocampal+nerve+terminals.">The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals.</a> J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).</li><li>Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+phluorin-based+probes+at+hippocampal+synapses.">Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses.</a> Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).</li><li>Moulder, K. L., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reluctant+vesicles+contribute+to+the+total+readily+releasable+pool+in+glutamatergic+hippocampal+neurons.">Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).</li><li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptopHluorin.">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).</li><li>Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+a+neurobiological+theory+of+hippocampal+function:+the+role+of+synaptic+plasticity,+synaptic+tagging+and+schemas.">Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas.</a> Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).</li><li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+accelerates+endocytosis+of+vSNAREs+at+hippocampal+synapses.">Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).</li><li>Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+endocytic+capacity+at+a+CNS+synapse.">Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse.</a> J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).</li><li>Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+activity-dependent+requirement+for+dynamin+1+in+synaptic+vesicle+endocytosis.">A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis.</a> Science. 316 (5824), 570-574 (2007).</li><li>Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+inhibits+calcium+channel+activation,+exocytosis,+and+endocytosis+at+a+central+nerve+terminal.">Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal.</a> J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).</li><li>Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+universally+involved+in+vesicle+endocytosis+at+neuronal+and+nonneuronal+secretory+cells.">Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells.</a> Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).</li><li>Zhang, Z., Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SNARE+proteins+SNAP25+and+synaptobrevin+are+involved+in+endocytosis+at+hippocampal+synapses.">The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses.</a> J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).</li><li>Wu, L. -. G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).</li><li>Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIRFM+and+pH-sensitive+GFP-probes+to+evaluate+neurotransmitter+vesicle+dynamics+in+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells:+cell+imaging+and+data+analysis.">TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis.</a> J Vis Exp. (95), e52267 (2015).</li><li>Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).</li><li>Leitz, J., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+retrieval+and+autonomous+regulation+of+single+spontaneously+recycling+synaptic+vesicles.">Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles.</a> Elife. 3, e03658 (2014).</li><li>Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., S&#225;nchez, M. G., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+to+Study+Microglial+Interactions+with+&#946;-Amyloid+Plaques.">Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques.</a> J Vis Exp. (112), e54060 (2016).</li><li>Schikorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Synaptic+Vesicle+Protein+Sorting+with+Enhanced+Horseradish+Peroxidase+in+the+Electron+Microscope.">Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope.</a> High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).</li><li>Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin/AP-2+mediate+synaptic+vesicle+reformation+from+endosome-like+vacuoles+but+are+not+essential+for+membrane+retrieval+at+central+synapses.">Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses.</a> Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).</li><li>Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamin+1-,+dynamin+3-+and+clathrin-independent+pathway+of+synaptic+vesicle+recycling+mediated+by+bulk+endocytosis.">A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis.</a> eLife. 2014 (3), e01621 (2014).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+recycling+of+synaptic+vesicle+membrane+during+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+transmitter+and+synaptic+vesicles+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).</li><li>Watanabe, S., Rost, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li><li>Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+has+a+molecular+scaffolding,+not+propulsive,+role+in+presynaptic+function.">Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).</li><li>Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pathways+of+synaptic+vesicle+retrieval+revealed+by+single-vesicle+imaging.">Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging.</a> Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., Garc&#237;a-C&#225;novas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+peroxidase+by+hydrogen+peroxide+and+its+protection+by+a+reductant+agent.">Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent.</a> Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).</li><li>De&#225;k, F., Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptobrevin+is+essential+for+fast+synaptic-vesicle+endocytosis.">Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).</li><li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+presynaptic+function.">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li><li>Wienisch, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+proteins+exocytosed+and+subsequently+retrieved+by+compensatory+endocytosis+are+nonidentical.">Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical.</a> Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling.">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li><li>Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+spread+and+confinement+of+newly+exocytosed+synaptic+vesicle+proteins.">Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins.</a> Nat Commun. 6, 8392 (2015).</li><li>Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+activity-dependent+bulk+endocytosis+with+the+genetically-encoded+reporter+VAMP4-pHluorin.">Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin.</a> J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).</li><li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin.">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li><li>Wisse, E., Braet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver.">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+Photodamage+in+Live-Cell+Microscopy.">Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>S&#248;ndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+artifacts+in+protein-ligand+X-ray+structures:+implications+for+the+development+of+docking+scoring+functions.">Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions.</a> J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן נדגים שתי שיטות לניטור אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית. בשיטה הראשונה, אנחנו במעקב pHluorin התמזגו עם חלבון שלפוחית סינפטית בנוירונים transfected, לאחר מכן חשמלית מגורה. שנית, השתמשנו EM הדמיה של ספיגת HRP כפי שנגזרות אשלגן כלורי. השתמשנו גירויים שונים משתי סיבות. ראשית, יישום אשלגן גבוה גורם דפולריזציה של נוירונים כל בתרבות. זה מקל על הבדיקה EM, בהתחשב בכך המתודולוגיה שלנו אם לא יכול היה להבחין בין נוירונים שאינם מגורה ולא מאולצת. שנית, אולטרה מבניים שינויים מורפולוגיים נצפו בצורה מהימנה יותר לאחר גירוי חזק, כגון גירוי אשלגן גבוהה, ואילו שינויים זריחה pHluorin יכול להיות שנצפו לאחר רכבת קצרה של פוטנציאל פעולה או אפילו פעולה בודדת פוטנציאל.
מיקרוסקופ אור הדמיה באמצעות pHluorin מראה שלפוחית סינפטית חלבון פיוז'ן ספיגת עם רזולוציה טמפורלית גבוהה בתאים חיים. זה יכול לשמש כדי לחקור מנגנונים המסדירים את מהלך הזמן אנדוציטוזה והגודל של בריכות שלפוחית סינפטית. הדמיה pHluorin לא רק שימש לניטור חלבונים סינפטיים אנדוציטוזה, אבל גם לניטור שחרור שלפוחית אחת עורר או ספונטנית, פלסטיות סינפטית לטווח קצר, ועל מידת הסתברות השחרור35. שימוש pHluorin הראו כי הבריכות חלבונים סינפטיים vesicular ששוחרר אינם זהים לאלה להיות שאוחזרו36,37. לאחרונה, pHluorin התמזגו עם חלבונים סינפטיים שימש כדי לזהות את גורלו של שלפוחית לאחרונה מאוחה38ולאחר פרירים אנדוציטוזה39. לכן, pHluorin התמזגו עם חלבון סינפטית היא כלי חשוב ללמוד אקסוציטוזה, אנדוציטוזה במחיה, הסינפסות.
המגבלה של טכניקה זו היא כי הדעיכה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית משקף לא רק endosomes, אלא גם vesicular acidification מחדש. שני המרכיבים יכול פוטנציאלית להיות מופרדים על ידי טיפול עם bafilomycin, מעכב של V-ATPase10,40. יתר על כן, העלייה פלורסצנטיות במהלך גירוי חשמלי משקף את התוצאה נטו ושל אקסוציטוזה אנדוציטוזה. למרות pHluorin הדמיה לא היתה אפשרות לזהות את הממברנה invagination, מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי טכניקות אחרות, במיוחד EM.
ב EM, תאים מאוד מגורה הראה מוגברת HRP-חיוביות הסינפטיות בצובר endosomes. אלה בצובר endosomes נעלם בהדרגה על ידי ואז נוצר מחדש לתוך הסינפטיות24. טכניקה זו מציגה את ספיגת שלפוחית סינפטית חושף את ultrastructure בתוך הטרמינל presynaptic שליטה והן תאים מגורה. חיסרון כדי טכניקה זו היא הערכת שלפוחית סינפטית ספיגת תאים קבוע יותר מאשר תאים חיים. בנוסף, האפשרות של חפץ המושרה מקבע לא ייכללו. חפצים מוכרים המשפיעים על הקרום כוללים blebbing, שחיקה ממברנה חלבון שינויים41. הבדלים אלה ממצב טבעי של תא הן דאגה הטבועה כל השיטות של תאים להמחיש, תשומת לב מיוחדת הוקדשה הנתונים אותם הציגה כדי להעריך את האפשרות של כזה חפצים41,42 ,43. בעוד טכניקה זו לבד לא יכול להראות פונקציונלי אנדוציטוזה חלבונים סינפטיים, שילוב עם מיקרוסקופ אור, אשר יכול לספק תמונות בשידור חי של תהליך אנדוציטוזה, יוצר תצוגה מלאה יותר של מנגנון זה הסלולר.

נוירוטרנסמיטרים מאוחסנים הסינפטיות, שפורסמו על ידי אקסוציטוזה. קרום שלפוחית סינפטית של חלבון לאחר מכן על ידי אנדוציטוזה הינם בשימוש חוזר לסיבוב הבא של אקסוציטוזה. אנדוציטוזה של הסינפטיות חשוב לשמירה על שלפוחית סינפטית בריכות ומסירה שלפוחית הבולטות של קרום פלזמה. PHluorin רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק, אשר הוא מתרצה בנסיבות חומצי, dequenched ב pH ניטראלי, שימש כדי למדוד זמן אנדוציטוזה קורסים לחיות תאים1,2,3. החלבון pHluorin מחובר בדרך כלל לצד lumenal של חלבונים שלפוחית סינפטית, כגון synaptophysin או VAMP2/synaptobrevin. במצב מנוחה, pHluorin הוא מתרצה ב- 5.5 pH לומן של הסינפטיות. פיוז'ן שלפוחית על קרום פלזמה חושף לומן vesicular לתמיסה חוץ-תאית איפה ה-pH ~ 7.3, וכתוצאה מכך עלייה בזריחה pHluorin. לאחר אקסוציטוזה, נרקב זריחה מוגברת, עקב אנדוציטוזה של חלבונים שלפוחית סינפטית ואחריו שלפוחית acidification מחדש בתוך שלפוחית התאושש האלה. למרות הריקבון משקף אנדוציטוזה והן vesicular acidification מחדש, הוא משקף בעיקר אנדוציטוזה, כי acidification מחדש הוא מהיר יותר מאשר אנדוציטוזה רוב התנאים1,4. קבוע הזמן של acidification מחדש הוא 3-4 s או פחות5,6, שהוא בדרך כלל מהיר יותר 10 s או יותר הדרושים עבור שלפוחית אנדוציטוזה4,5. אם הניסויים נדרשים לבידול אנדוציטוזה acidification מחדש, חומצה שכבתה ניסויים באמצעות 4-Morpholineethanesulfonic חומצה (MES) הפתרון (25 מ מ) עם pH של 5.5 יכול לשמש כדי לקבוע אם חלבונים שלפוחית סינפטית מאוחזרות של קרום פלזמה ויה אנדוציטוזה-1,-3,-4. לפיכך, העלייה עוצמת קרינה פלואורסצנטית pHluorin משקפת איזון של מסכות, אנדוציטוזה ולאחר הירידה לאחר גירוי עצבי משקף באופן ספציפי אנדוציטוזה.
הדמיה pHluorin עשוי לשמש לא רק כדי למדוד את מהלך הזמן של אנדוציטוזה, אלא גם את הגודל של שלפוחית סינפטית בריכות7,8, ולשחרר ההסתברות של שחרור עורר וספונטני9. גורמים רבים, חלבונים מעורב בוויסות אנדוציטוזה, כגון סידן, מסיסים NSF-מצורף חלבון קולטן (מוקש) חלבונים, המוח, נגזר neurotrophic factor(BDNF) calcineurin זוהו באמצעות הדמיה pHluorin1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. יתר על כן, שחרור נוירוטרנסמיטר יכול להתגלות נוירונים לא רק העיקרי אלא נוירובלסטומה תאים עם TIRFM17. לאחרונה, גרסאות pHluorin, dsRed, מורנג ו pHTomato פותחו לפיקוח הסימולטניות הקלטות של גורמים רבים ב18,סינפסה בודדת19. לדוגמה, pHTomato יש כבר התמזגו עם synaptophysin, נהגה עם מחוון סידן מקודדים גנטית (GCaMP5K) לפקח על שלפוחית presynaptic fusion ו Ca2 + זרם ב ה תא postsynaptic20. לכן, pHluorin מחוברים חלבונים סינפטיים מספק שיטה שימושית כדי לנתח את הקשר בין אקסוציטוזה אנדוציטוזה.
EM הוא שיטה נוספת בשימוש נפוץ ללמוד אנדוציטוזה, בשל הרזולוציה המרחבית הגבוהה זה מציגה את השינויים ultrastructural במהלך אנדוציטוזה. בשני תחומים כלליים הן את היכולת להמחיש שינויים פתולוגיים בתוך תאים עצביים21 ולעקוב אחר שלפוחית חלבונים22. בפרט, ההתבוננות שלפוחית סינפטית תפיסה, ממברנה עקמומיות מצופה מאת clathrin באיזור periactive, endosomal מבנים אפשריים עם EM3,23,24,25 ,26,27,28. בעוד EM כרוך לכלוכים פוטנציאליים, כגון מקבע-induced מומים, זה עלול להשפיע על אנדוציטוזה ולאחר ניתוח נתונים הוא עמל רב, שהפתרון מספק הזדמנות אטרקטיבית להמחיש המבנה התאי. בעיות פוטנציאליות מקבע והגבלת ברזולוציה הטמפורלית EM ניתן להתגבר על ידי לחץ גבוה קפוא, מתן שיטה מהירה ללא כימיקלים לייצב את המבנים עדין נוכח בזמן אנדוציטוזה27.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine LTX with Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338-100</td><td>Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin</td></tr><tr><td>neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td>Growth medium for neuron, Warm up to 37&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504-044</td><td>Gradient for neuronal differentiation</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td>Gradient for neuronal culture</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine coated coverslip</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25-pdl</td><td>Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin</td></tr><tr><td>Trypsin XI from bovine pancrease</td><td>Sigma</td><td>T1005</td><td>Neuronal culture-digest hippocampal tissues</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension</td></tr><tr><td>pulse stimulator</td><td>A-M systems</td><td>model 2100</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>Slotted bath with field stimulation</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>stimulus isolation unit</td><td>Warner Instruments</td><td>SIU102</td><td>Apply electrical stimulation</td></tr><tr><td>lubricant</td><td>Dow corning</td><td>111</td><td>pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber</td></tr><tr><td>AP5</td><td>Tocris</td><td>3693</td><td>Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>190</td><td>Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Metal halide light source for pHluorin</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon3</td><td>pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity</td></tr><tr><td>Inverted microscopy</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Software for imaging acquisition and analysis</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor pro</td><td>Software for imaging analysis and data presentation</td></tr><tr><td>imaging chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC21B</td><td>pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells</td></tr><tr><td>poly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase(HRP)</td><td>Sigma</td><td>P6782</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use</td></tr><tr><td>Na cacodylate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N</td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-Diaminobenzidine(DAB)</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use</td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16365</td><td>Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use</td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL</td><td>200CX</td><td>Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes</td></tr><tr><td>CCD digital camera</td><td>AMT</td><td>XR-100</td><td>Electron microscopy, capturing images</td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>Leica microsystems</td><td>16707235</td><td>Electron microscopy, grid staining</td></tr></tbody></table>

measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons

במהלך אנדוציטוזה, מאוחה הסינפטיות מאוחזרות על קצות עצבים היקפיים, המאפשרות שלפוחית מיחזור, ובכך את התחזוקה של ההעברה הסינאפסית במהלך ירי עצב חוזרות. אנדוציטוזה לקוי בתנאים פתולוגיים מוביל ירידות סינפטית כוח, המוח מתפקד. כאן, אנו מתארים שיטות למדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית על הסינפסה בהיפוקמפוס יונקים בתרבות עצביים. אנחנו בפיקוח שלפוחית סינפטית חלבון אנדוציטוזה פיוזינג חלבון ממברנה vesicular סינפטית, כולל synaptophysin ו VAMP2/synaptobrevin, בצד lumenal vesicular, עם pHluorin, רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק זה מגביר שלה עוצמת קרינה פלואורסצנטית כמו ה-pH מעלה. במהלך אקסוציטוזה, מגביר לומן vesicular pH, ואילו במהלך אנדוציטוזה vesicular לומן pH הוא acidified מחדש. לפיכך, גידול של עוצמת קרינה פלואורסצנטית pHluorin מציין היתוך, ואילו ירידה מציין אנדוציטוזה של החלבון שלפוחית סינפטית עם תוויות ברורות. בנוסף לשימוש בשיטת הדמיה pHluorin להקליט אנדוציטוזה, אנחנו בפיקוח אנדוציטוזה ממברנה vesicular על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מדידות של ספיגת peroxidase (HRP) חזרת שלפוחית. בסופו של דבר, אנחנו פיקוח היווצרות של חוצפה רפידה מסוף בורות בזמנים שונים לאחר דפולריזציה הנוצרות על-ידי אשלגן גבוה. מסלול הזמן של ספיגת HRP בור היווצרות קרום מציין את מהלך הזמן של אנדוציטוזה.

שימוש בשיטת המוביל השומנים, SpH בא לידי נוירונים בהיפוקמפוס, המאפשרות הזיהוי עם העיתון ons (איור 1 א'). גירוי חשמלי של התאים הנגרמת אקסוציטוזה, וגידול מקביל בעוצמתם זריחה. העלייה ברמת קרינה פלואורסצנטית (ΔF) נעצר על ידי סיום הגירוי (איור 1b). ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברת בעקבות ירידה איטית, עקב אנדוציטוזה. במקרה של VAMP2-pHluorin, VAMP2 מפזרת לאורך הפעולה באקסון של בוטון לאחר גירוי4. הנתונים הגולמיים להשתמש יחידות שרירותית, ולא היה מנורמל לקו הבסיס כדי לקבל קצב הדעיכה, τ (איור 2a–c). מאז המדידות נעשו מתוך עקבות מנורמל, שיעור הריקבון משקף את הדעיכה הראשונית של קרינה פלואורסצנטית באחוזים של ΔF שיא לשניה (ΔF/s). בתנאי הניסוי שלנו, אנדוציטוזה (בדרך כלל יותר מ 10 s) היה איטי יותר מאשר reacidification (~ 3-4 s)4,5. לפיכך, התפוררות זריחה pHluorin משקפת בעיקר אנדוציטוזה4,5. ב- presynaptic עם העיתון ons, ΔF הוא גדול יותר מאשר האקסון חוץ בוטון והתאמתי תחילת הזמן-של-העלייה הייתה חניכה של גירוי חשמלי. האקסון חוץ בוטון, ΔF היה נמוך לעומת אזורים עם העיתון ons, מתחיל זמן-של-עלייה עוכב בהשוואה אתחול של גירוי חשמלי (איור 2b). ΔF המושרה בוטון, האקסון אלא בוטון היה 82.9 ± 9.0% (n = 5 ניסויים) ו- 23.2 ± 4.0% (n = 5 ניסויים), בהתאמה (איור 2b). ΔF של SpH מתנוונים מונו-אקספוננציאלית עם τ של 17.7 ± 0.3 (n = 5 ניסויים), 20.7 ± 0.2 (n = 4 ניסויים) ב-50 AP ל- 200 AP, בהתאמה (איור 1b). בשנת 200 AP, τ לא היתה שונה באופן משמעותי לפני או אחרי נרמול לקו הבסיס. במקרה של VAMP2-pHluorin transfected תאים, רמת הביטוי של VAMP2-pHluorin היה גבוה יותר מאשר SpH (איור 3 א–c). עקבות של VAMP2-pHluorin התקבלו גם על ידי נרמול לקו הבסיס (איור 3b).
EM בוצע בנוירונים בתרבית, השלפוחיות המוגלתיות clathrin מצופה נבחנו בהשוואה דגימות הבקרה, שבו היו מודגרות עם 5 מ"ג/מ"ל של HRP עבור 90 s בהעדר הגירוי (איור 4a–b). הבורות clathrin מצופה נצפו ב הסתברות 0.05 לכל בוטון בהיעדר גירוי. גירוי עם K גבוה+ המושרה אנדוזום בתפזורת, ספיגת הסינפטיות, אשר זוהו על ידי HRP תיוג (איור 5a). הסינפטיות הוגדרו כמו שלפוחית עם endosomes בקוטר של פחות מ 50 ננומטר ו בתפזורת הוגדרו כבעלי בקוטר מעל 80 ננומטר או עם אזור חתך צלב של יותר מ-80 שלפוחית ננומטר. ספיגת אנדוזום בצובר המושרה ירדו בכ שחזור עם תמיסת מלח (איור 5b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55862/55862fig1.jpg"> 
איור 1: תמונות של SpH transfected נוירונים ועקבות של תגובות תא SpH transfected גירוי חשמלי- () מדגם התמונה של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית transfected עם SpH על ידי ליפוזום משלוח. SpH היה מאוד לידי ביטוי עם העיתון ons, מציג דפוסי עיגול או אליפסה, עם ביטוי נמוכות יחסית לאורך האקסון. תיבות לבנות מצביעות על רועי המכיל עם העיתון ons (1.5 x 1.5 מיקרומטר). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (b) תגובות של SpH transfected לתאים גירוי חשמלי של 50 AP ב 20 הרץ (n = 5 ניסויים) או 200 AP ב 20 הרץ (n = 4 ניסויים). ניסוי היה מבוסס על העיתון ons 20-60. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55862/55862fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55862/55862fig2.jpg"> 
איור 2: שיעור הריקבון וערך טאו עבור אנדוציטוזה. AP () תגובות ל- 50-20 הרץ היו המרה מיחידות שרירותי עקבות מנורמל (n = 5). קרינה פלואורסצנטית שינוי היה מנורמל בתוכנית הבסיסית. איור זה השתנה מ וו. et al., 20163. (b) Normalized תגובות ל-200 AP ב 20 הרץ בעם העיתון ons (n שחור, = 4 ניסויים, עזב לוח), האקסון חוץ בוטון (אדום, n = 4 ניסויים, עזב לוח). קרינה פלואורסצנטית שינוי היה מנורמל בתוכנית הבסיסית. תיבת מקווקו מוגדל בלוח הימני. (ג) שימוש בסיסית מנורמל, הקצב של דעיכה או τ חושבה ב-50 AP (n = 5 ניסויים) ו-200 AP (n = 4 ניסויים)-20 הרץ. לפני חישוב, ΔF היה מנורמל ל- 100%. Τ של אנדוציטוזה הושג מחומרים מנורמלת בין שעת זריחה המרבי בסוף הניסוי. קצב של ריקבון (כלומר + s.e.m., החלונית העליונה), τ (כלומר + s.e.m., החלונית התחתונה) הנגרמת על ידי 50 AP ל- 200 AP.  <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55862/55862fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55862/55862fig3.jpg"> 
איור 3: תמונות של VAMP2-pHluorin transfected נוירונים ודוגמאות של עקבות. () א תמונה לדוגמה של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית transfected עם VAMP2-pHluorin על ידי ליפוזום משלוח. תיבות לבנות מצביעות על רועי המכיל עם העיתון ons (1.5 x 1.5 מיקרומטר). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (b) עקבות VAMP2-pHluorin של תגובות ל-200 AP ב 20 הרץ (n = 4 ניסויים). קרינה פלואורסצנטית שינוי היה מנורמל בתוכנית הבסיסית. (ג)הבסיס (א"א) (ממוצע + s.e.m.) VAMP2-pHluorin (n = 4 ניסויים) ו- SpH (n = 7 ניסויים) transfected עם העיתון ons. * *, p &#60; 0.01. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55862/55862fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55862/55862fig4.jpg"> 
איור 4: תמונות של EM בטרמינל presynaptic. שלפוחית () Synaptic הוצגו בתרבותי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות EM. איור זה השתנה מ וו. et al., 20163. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. תמונה Magnified (b) מציג clathrin מצופה בורות. סרגל קנה מידה: 50 ננומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55862/55862fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55862/55862fig5.jpg"> 
איור 5: תמונות של presynaptic מסוף בנוירונים מגורה עם אשלגן גבוהה. () EM תמונות של נוירונים. התאים היה קבוע ללא גירוי (R), מיד לאחר גירוי עם 90 מ מ מתקרב, התחבאו במשך 90 s המכילה HRP מסיסים (K+), או לאחר גירוי, מודגרות ואז 10 דקות בתוך תמיסת מלח רגיל. איור זה שונה מוו. et al., 20163. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (b) Compared כדי לשלוט, HRP (-) הסינפטיות ירדו, HRP (+) שלפוחית היו מוגברת על ידי אשלגן כלורי. בצובר אנדוזום ספיגת היה שנגזרות אשלגן כלורי, ירד בהדרגה על ידי שחזור (ממוצע + s.e.m., כל קבוצה היה מפרופילים סינפטית 40-100). * p &#60; 0.1; * * p &#60; 0.01, משמעותי לנוח; ##p &#60; 0.01, משמעותית ל K+. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55862/55862fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K Views.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

Video: Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biology

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons 

<a href='https://app.jove.com/v/55862/measuring-synaptic-vesicle-endocytosis-in-cultured-hippocampal-neurons'>Source: Villarreal, S., et. al., Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2017)</a>This video demonstrates the analysis of synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons through horseradish peroxidase labeling and electron microscopy.

Source: Villarreal, S., et. al., Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the ...

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

Transmission Electron Microscopic Imaging of Synaptic Vesicle Endocytosis in Mouse Hippocampal Neurons

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured